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    2016年12月(总第27期)

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白泽专栏丨在肿瘤免疫治疗中的慢病毒载体

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在肿瘤免疫治疗中的慢病毒载体

Robyn AA Oldhan, Elliot M Berinstein, Jeffrey A Medin

 

概要

慢病毒载体提供有效的和可能的基因传递的安全系统

慢病毒载体(LVs)来自复杂的逆转录病毒,具有传染非分裂细胞的能力。

基因整合特性允许长期、稳定转基因表达。

与γ逆转录病毒相比,LVs具有较低的插入突变倾向。

为了增大LVs的安全性,补偿性改变已进行  

第三代基因封装系统和自失活载体可达到止防止慢病毒复制形成的目的。

利用异体的不强增强子功能的启动因子可降低了插入突变频次。

细胞命运控制安全系统允许靶向清除LV转染细胞  

例如常规的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的自杀系统,用于接受治疗的病人,能选择性清除转染细胞。

新系统,如dCK 和  TMPK,寻求避免与HSV-TK相关问题,如免疫源性和无效药物前体转换引起的不完全杀灭。  

肿瘤疫苗

用LV转染改进了DC疫苗:通过提供更稳定更天然的抗原提呈表达机制、帮助制备有效的、可替代的DC前体细胞、延长DC在体外寿命。

LV与共刺激结构域和/或细胞因子转染肿瘤细胞有助于诱导肿瘤特异性免疫反应并保存持续性免疫。

过继T细胞治疗

具有高度亲和力和活性的T细胞受体并能趋向特异性肿瘤已经被亚克隆到病人的T细胞中,使其产生特异性的抗肿瘤T细胞反应。 

双顺子的LVs开发帮助提供了稳定和有效的T细胞受体双链基因的传递。

嵌入抗原受体通过LV转染使免疫细胞具备了选择识别和杀灭癌症细胞的能力。

结论

在癌症免疫治疗中应用LVs是一个不断扩大的领域。

LVs可直接用于转染肿瘤细胞产生抗肿瘤作用或使免疫细胞强大而产生特异的、增强的抗肿瘤反应。

 

 
 

基础科学在癌症免疫治疗的进展已经使各种治疗方法在临床上取得了成功。很多疗法需要将基因插入细胞中,直接杀死目标细胞或重新引起宿主细胞产生强烈地免疫反应。其他类似的治疗方法是通过修饰效应细胞来改善靶向性和增强对肿瘤细胞的杀伤力。最初使用γ逆转录病毒的研究显示了很好的前景,但是对插入突变的潜在安全考虑强化了人们开发基因传递技术的欲望。慢病毒载体(Lentiviral vectors, LVs)被认为是潜在的更有效和更安全的转递载体。LVs已经被用于许多不同类型的遗传和后天疾病包括癌症的临床试验。本文将讨论目前我们对LVs的认识,以及基于病毒载体传递在癌症免疫疗法中的应用。

 
 

关键词:癌症,细胞命运控制系统,细胞免疫,嵌合抗原受体,细胞因子,树突细胞,免疫治疗,慢病毒,T细胞,转基因

 
 

癌症免疫疗法是指为了清除肿瘤细胞而利用免疫系统的治疗方法。体内的免疫细胞本来已拥有识别和攻击恶性肿瘤的机制; 然而,肿瘤细胞经常采取对抗这些机制的措施,致使其失效。免疫疗法通过各种不同的方法寻求增强和补偿这些正常反应,包括抗体和细胞因子疗法,癌症疫苗和过继细胞输入。无论是直接杀灭、诱发免疫反应或者提高免疫细胞的靶向性和细胞毒性,这些治疗方法都要求对病患细胞进行基因修饰。为了使这些基因疗法在临床中切实可行,必须要有一套能安全和有效地传递基因的可靠方法。迄今为止,许多不同的方法已经在研究和测试。

 

用重组γ逆转录病毒(akaoncoretrovirus,也称致癌逆转录病毒)把一个特定的T细胞受体转入淋巴细胞用于治疗黑素瘤,是第一个探索从改造免疫细胞基因实现癌症免疫治疗的临床试验。这项工作自2006年公开发表以后,利用各种基因传递方法探索了许多不同的癌症免疫治疗方法。一些病毒和非病毒式的系统现在已经应用。重组γ(Gamma)逆转录病毒仍然是一个常见的选择;然而,慢病毒载体(LVs)成为另一种潜在的、更有效和更安全的选择已经出现。到2014年1月,γ(Gamma)逆转录病毒被用于19.2%的基因治疗试验[2]。但目前,在所有公开和以往试验中,LVs只占3.5%,然而,这个数字正在增加[2]。

 

其他常用的病毒基因传递方式包括重组腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)。腺病毒载体表达滴度较高,但是可引起不良的免疫反应,并且不整合到宿主基因组中限制了基因表达的持久性[3]。已知野生型AAV更倾向整合至基因组的一个位点,但是重组AAV的整合并不在可预知的效率[4]。此外,AAV载体容量较小,限制了其传递基因的大小[5]。γ逆转录病毒和LVs都能够有效地将它们的DNA插入宿主基因组中,从而使转基因产品得以稳定和长期的表达。这有助于确保最大的治疗效果,这也是为什么这些载体经常被选择用于针对癌症免疫疗法的原因之一。

 

慢病毒生物学与生命周期

LVs属于逆转录病毒科,但它们比γ逆转录病毒拥有更复杂的基因组。所有逆转录病毒都包含病毒感染和复制所需的基本基因组。这些包括编码结构蛋白的gag基因、编码酶蛋白的pol基因,和编码包壳糖蛋白的env基因。LVs也具有病毒复制需要基因rev和tat,和辅助基因vif,vpr,vpu和nef。这些辅助基因的功可见Malim和Emerman发表的综述[6[。结构蛋白对于环绕病毒颗粒核心RNA的包装性结构序列是必不可少的。病毒核心包含两套完全相同的RNA与酶蛋白整合酶,逆转录酶和蛋白酶,与核衣壳蛋白形成复合体[7]。从外面到核心是与脂质膜的外层相互作用的基质蛋白质层。env基因编码的糖蛋白镶嵌在外层。

病毒感染启始于env编码的糖蛋白与细胞膜上的受体结合。在LV介导的基因治疗应用,最常用的包壳蛋白是来自疱疹性口炎病毒的糖蛋白,它通过与低密度脂蛋白(LDL)受体和类似的家族成员结合使病毒具有一种广泛的亲向性[8]。这个结合可让病毒与细胞融合,然后病毒的内容被传送到细胞内部。一旦进入,病毒就会脱壳,病毒核心成分释放到细胞质中。这包括单链RNA基因组,再转化为cDNA,转移到细胞核。在γ逆转录病毒感染过程中,细胞必须在病毒DNA进入细胞核之前进行分裂(也就是核膜的溶解)。另一方面,LVs,还有其他的特性,包括中心DNA活瓣和其他不确定因素,允许病毒DNA通过完整的核膜传递[9]。γ逆转录病毒和LVs两者都将它们(现在的双链)DNA整合到宿主基因组中,然后利用宿主基因组机制将它们的基因转录到RNA上。一旦来自野生型逆转录病毒的RNA复制并回到细胞质中,就被翻译并包装进一个新的病毒粒子,它将会从细胞芽胞释放,完成生命周期[10]。

 

 

 

慢病毒介导的基因传递安全性的发展历程

慢病毒转递系统

在基因疗法中,为了使安全性最大化,人们对LV基因组进行了许多改造。这些改变被分为三次迭代。在当前的第三代系统中,病毒基因组成份被分散进入一种包装质粒、一个转递质粒和一个包壳质粒,再转染进HEK 293T细胞进行病毒生产。包装质粒含有在病毒生产中转染所需要的所有元素。这包括结构基因,酶蛋白质gag,pol,以及病毒调控基因rev。另一种情况,rev可被第二个包装质粒来表达形成四质粒系统。传递质粒含感兴趣的基因和必要的顺式调控元件,比如Ψ (psi)RNA包装信号,3'和修饰的5’LTR元件[11]。这个修改过的5'LTR用有活性的tat独立启动子替换了内源性HIV启动子,允许tat基因不在包装质粒上[12]。env编码蛋白在一个分开的质粒中被表达出来,这样可以改变病毒的亲和性,也称为假性配型。这种多质粒系统保证了在随后的转染中只保存感兴趣的转基因和顺式作用序列。一些不必要的病毒蛋白,如辅助蛋白,被一起被忽略,这样有助于降低免疫原性[13],而删除这些编码序列进一步降低重组导致可复制潜能的慢病毒产生的可能性。

在第二代和第三代系统中,有了进一步安全方面的改进,包括自身失活的转染载体的开发。这是通过把转染载体的3′LTR的U3部位删除实现的,在逆转录和整合之后被转移到5'LTR,使LTR启动子活性有效地减少[14,15]。此外,这个删除没有根本性影响病毒的滴度,又减少了启动子的干扰,因为启动子干扰可能导致不良的转基因沉默。病毒基因分裂成不同的质粒,以及自灭活转染载体的使用,进一步降低了有复制能力的慢病毒产生的可能性。

其他优化载体的方法也进行了研究,包括中央多嘌呤片段的插入,可其改善预整合复合体的核内转运 [16],及土拨鼠乙肝病毒转录后调控元素,后者在促进转基因方面发挥作用[17]。这些特性协同工作以提高转染效率和转基因表达[18]。细胞特异性或诱导型启动子也是很有用的工具。细胞特异的启动子或组织特异的启动子,可靶向转基因在特异组织表达,例如肿瘤细胞,目的是减少脱靶效应。另外,诱导型启动子,通过服用抗生素如四环素,可以在需要的时候打开或关闭基因表达[19]。在癌症免疫疗法的背景下,免疫细胞可根据需要携带整合原病毒来提供抗癌治疗,但是降低持续转基因表达有助于减少不良副作用。

插入突变的风险

不论对基因传递系统怎样改造和优化,对LV安全性的担忧仍然存在。担忧主要在于插入基因发生突变的潜在风险。第一种明确的成功的利用γ逆转录酶病毒的基因治疗,是针对儿童重症联合免疫缺陷疾病(SCID-X1)[20]。不幸的是,基因治疗后,许多病人发生了白血病。逆转录病毒生命周期的基因组整合步骤是一种非定向插入,因此,有机会整合进一个调节生长的位点。可能发生前病毒插入的一些“热点”已经证实。为了评估插入突变的相关风险,Cattoglio等人在2007年进行的一项研究中,绘制了LV和γ逆转录病毒感染CD34+造血细胞的“热点”图。γ逆转录病毒在“热点”中插入的机率大约21%,并常见在原癌基因和生长控制基因[21]。而LVs插入热点的机率较小,大约有8% ,并且不在原癌基因和生长控制基因[21]。在LV转染进骨髓细胞[22]和肝细胞[23]的体内研究中,发现前病毒插入主要发生在有活性的基因中,插入部位不在与生长有关的基因。此外,LV感染后没有观察到克隆性扩张[22,23],提示载体诱导肿瘤发生的风险很低。到目前为止,这项工作支持重组的LVs相对于修饰后的γ逆转录病毒更安全的推论。

设计的核酸酶

另外一种已经在研究的处理插入引起突变潜在问题的方法是开发非整合的慢病毒载体(NILVs) [24]。具体地说,整合酶基因蛋白的点变化阻止了基因组整合;换句话说,含有转基因的质粒仍然游离地保留在细胞核中[25]。这种策略产生的转基因表达比整合载体更低,而且是瞬时表达转基因[26]。这项技术进一步允许NILV DNA通过使用锌指核酸酶(ZFNs)在一个特定的目标靶点上进行同源重组,而产生双链断裂来启动同源修复通路[27]。

这个方法允许对基因序列进行靶向校正,以降低插入突变的风险。转录激活样效应核酸酶(TALENs)在功能上类似于锌指酶(ZFNs),但是其DNA识别域的设计更简单,也更灵活。最近发表的一项研究,报告了靶向人类蛋白质编码基因的18740个TALENs构建情况[28]。临床前研究表明,NILVs已经被证明在癌症免疫疗法里是有用的。它们已经被单独应用,比如利用NILVs做癌症疫苗[29],以及与设计者核酸酶结合,就像在T细胞里结合锌指酶(ZFNs)表达肿瘤特异性T细胞受体(TCRs),从而干扰内源性TCR基因以增加其效力和安全性[30]。

基因组编辑系统 CRISPR/Cas 是最近开发的另一种实施特定位点双链断裂方法;该系统利用RNA分子标识切割位点并由Cas核酸酶切割[31]。在小鼠胚胎干细胞使用LVs和CRISPR系统实现定点诱变的功能缺失筛选,其方法比RNAi 更有效地抑制基因表达[32]。LVs和人类细胞的研究也已完成,在2013年吉尔伯特等将失活的Cas9与调控蛋白融合,依靠RNA引导实现基因的定向抑制或激活。在转染14天后,CRISPR/Cas转基因仍能继续稳定表达[33]。   

虽然上述的技术前景广阔且肯定在进一步发展,有一些问题需要克服。由于同一或同源的DNA序列而导致的脱靶突变是ZFN和TALEN系统的一种风险,crispr/cas系统甚或风险更大[34]。为了解决这个问题,仔细地选择靶位点和控制CRISPR/Cas剂量有益于减少风险[35,36]。其他选项,例如转换Cas9到切割酶的方法也正在研究[37]。ZFN切割酶的开发已经被报道[38–40]。这个系统的效率也在优化中。就CRISPR/Cas来说,下游间区序列邻近基序(PAM)需要限制了靶向的位点,因此开发一个间区序列邻近基序的独立系统是有益的。这些系统在原代细胞中的效率是另外一个妨碍其广泛使用的问题。最后,这些系统的转递模式还在开发中。因为大的转基因是病毒转染系统的一个限制因素,因为传递系统有大小限制。LVs可能对ZFN and CRISPR/Cas系统是个可行的选项,但对TALENs已经被证实是不相容,原因在于在转基因传递之后高度重复的TALEN序列的趋向于重新排列[41]。因此,进一步开发转基因交付技术将至关重要。

细胞命运控制安全元件(自杀机制)

细胞或基因治疗产品应用后可能会发生的副作用,细胞命运控制(也称为自杀机制)元件提供了一个缓解办法。这个方法涉及加入转基因序列,允许选择性地清除已用于病人身上的转基因细胞。这些系统通常是基于一种酶的特殊的突变形式,与细胞治疗序列一起转入靶细胞。这些被改变的酶使细胞具有能将一种无毒药前体转化为一种细胞毒性化合物,最终清除靶细胞。

传统的单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) cDNA是一个广泛使用的自杀系统,包括转换更昔洛韦(GCV)前体药成细胞毒性的更昔洛韦-三磷酸盐(GCV-TP)[42]。这个系统已经在临床试验取得成功。然而,靶细胞的消除并不总是完全有效。这可能是由于GVC-TP细胞毒性依赖于细胞周期的,因此是非分裂细胞是不受影响的。这可能是因为底物动力学活力不够和或有限转换过程的重新定位,到下一个途径中的酶(鸟苷酸激酶)是有问题的。这个不完全根除导致病人面对剩余的负作用。此外,GCV经常用于干细胞移植患者,作为一种预防药治疗机会性巨细胞病毒感染,由此,从清除疗法中排除了部分患者涉及安全系统的问题[43]。这个系统的免疫原性是第三个关心的问题。HSV-TK基因产品是病毒起原的,因此,它会在转染细胞中的存在通过宿主免疫系统在产生积极的效果之前引起它们的清除[44]。

为了应对与HSV-TK相关的缺陷,我们实验室开发了两套新的细胞命运控制系统。它们被称为TMPK[45]和dCK[46]。两个系统都是基于对人类酶的最小修饰,因此预计只会在病人中产生较低的免疫原性。此外,它们能以良好的安全性能与相关的动力学激活前体药。改变后的TMPK有能力激活前体药叠氮胸苷,成为有毒的叠氮胸苷三磷酸盐,从而导致细胞凋亡。这是在TMPK突变表达的细胞中通过降低线粒体内膜电位和caspase-3的激活来实现的[45].此外,我们近来也证明了突变的TMPK可以被有效地与细胞表面标志融合在一起,因此,载体滴度和跟踪功能与之相结合来达到根除的目的[47]。我们实验室开发的第二个系统是基于人类的脱氧胞苷激酶(dCK)。这种酶在核苷酸合成的补救途径中是必不可少的激酶。dCK的突变体被设计成含有多个活性的位点,这些位点允许酶去激活多种与临床相关的前体药,但是我们的工作主要集中在两个方面:BVdU和LdT[46]。这个系统是非常有选择性的,因为是野生型的dCK对这些化合物的转换不理想。此外,由于有多种前体药可用选择,也可以在根据不同病人上选择适当的效应化合物。

LVs在癌症免疫疗法的应用

免疫系统的操控,尤其是细胞免疫,正在成为抗癌一个重要的策略。考虑到这个研究/治疗领域里多样性的历史,不管是感知还是现实,真正的重生目前都正在发生。成功的治疗方法通常是两方面的:给免疫系统提供肿瘤相关靶点来识别;改造法去激活或者重定向宿主的免疫反应。在这里,我们将综述一下LVs是如何被用于癌细胞和免疫细胞的基因修饰,以起动和促进癌症免疫治疗。

 

 

癌症疫苗

树突状细胞疫苗

多种的策略已经应用于抗癌疫苗开发。他们的主要目标是刺激Th1的反应,包括细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),有选择性地靶向和消灭癌症。一类注定有利于促进抗癌疫苗治疗的细胞是树突状细胞(DCs)。DCs是专职的抗原提呈细胞,通过MHC-I、II获取、加工并向T细胞抗原。在这一过程中,DCs可以诱导特异性的Th1反应,包含CTLs。树突状细胞(DCs)受到炎症信号的刺激时,迅速成熟,加工和提呈抗原,并迁移到次级淋巴器官去引发免疫反应[48]。制备疫苗在某些方面可采集患者的树突细胞,接着在体外加载肿瘤相关抗原(TAA)。改造后细胞然后被回输给病人。这些负载的DCs有能力将处理过的TAAs提呈给T细胞,诱导Th1对表达TAA的细胞反应[49](见附图1D)。事实上,到目前为止,唯一经美国食品药品管理局批准的细胞调控免疫疗法是DC癌症疫苗,Sipuleucel-T。Sipuleucel-T治疗是向患者的DCs加载前列腺酸性磷酸酶(一种前列腺癌TAA)多肽和GM-CSF [50]来进行的。GM-CSF 是一种刺激巨噬细胞增殖和树突状细胞渗透的炎症细胞因子。这种组合成功地诱发了免疫反应,已经被证明可以延长患者的生命期平均为4个月。

 然而,以加载多肽为特征的DC疫苗疗法也面临几个障碍。体外将肿瘤抗原加在MHC是很短暂,阻止了长期的免疫效果。此外,这个反应是MHC单倍型的依赖,因此需要针对每一个病人进行个性化定制。此外,选择加载MHC复合体的特异肽序列是困难的,需要这个领域的研究继续优化这个选择过程。一个克服这些障碍的办法是用病毒载体携带完整的TAA cDNA去转染DCs[51]。已经证明了肿瘤抗原稳定表达,保证DC在免疫系统中以更自然的方式和在一个较长时间能处理和提呈抗原。

 

                  

图1. 慢病毒载体在肿瘤免疫治疗中的应用。CAR:Chimeric     antigen receptor; LV: Lentiviral vector; TAA: Tumor-associated antigen;     TCR: T-cell receptor

 

如上所述,DCs通过MHCs向T细胞的TCR显示处理过的抗原肽。然而,这个信号可能还不足以诱发T细胞反应。相反,已经表明这种相互作用可以独自导致T细胞失能和死亡[52]。在这种相互作用的基础上,更多的共剌激信号作为激活特性的免疫突触是诱导适当的细胞毒性T细胞反应所需要的[53]。细胞因子作为第三个信号帮助刺激和趋化细胞反应[54]。LVs用于加载DCs、激活它们的共同刺激信号,和/或者为了趋化T细胞释放特定的细胞因子。已经证明了,利用LVs可抑制DCs表面抑制性共刺激结构域PD-L1,可以加速抗肿瘤免疫反应[55]。此外,已经显示,用sPD-1或sPD-L1修饰DCs,以释放来干扰在免疫突触相互作用引起的CD80表达上调,一个共同刺激结构域激活和一个分别增高的肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素10(IL-10)细胞因子谱[56]。PD-1抑制剂已经显示可阻断T细胞抑制共刺激结构域,加速激活的DC中的抗肿瘤免疫反应[57]。另一种策略是使用LVs调节细胞内的通路。LVs修饰DCs 表达在p38 MAPK通路上的活跃蛋白,成功地增强抗肿瘤T细胞反应,延长荷瘤老鼠的存活时间[58]。在这项研究中,作者展示了激活p38导致上调共刺激结构域CD80、CD40和ICAM-I,帮助DCs诱发抗肿瘤T细胞反应[58]。许多增强DC疫苗的抗肿瘤潜力的策略正在探索中。

病毒载体也可以添加来自病毒蛋白的共刺激信号。这些共刺激信号可以帮助诱发免疫反应。例如,我们的实验室显示了Ad转染的DCs与LV转染的DCs相比有不同的免疫反应,当两者都表达HER/2抗原时[59]。Ad转染的DCs刺激CD4+和CD8+的T细胞反应,及强烈的体液反应。相反,LV转染DCs主要诱发的CD4+T细胞的反应,伴随着较高的IFN-γ分泌物浓度和较低的体液反应。这表明选择了病毒载体在DC疫苗引起的免疫反应中起着重要作用。因此,重要的是不仅要选择可靠的TAA,还要考虑最好的适合各个应用的传递载体。

正是LVs那些独特的品质,使它们可能成为有吸引力的病毒载体系统,把DCs转染成疫苗。如前所述,它们是有能力的在两种分裂和非分裂细胞中提供稳定的基因转移,具有较低的基因毒性系数。已经证明,LV转染独立于包膜伪型但依赖于细胞输入,LV转染激活DCs,释放1型干扰素(IFN),LV转染调制免疫原性去携带抗原[60]。进一步显示,这是通过TLR依赖机制发生的[61]。用LV进行各种TAAs转染的DCs已经在小鼠身上进行了临床试验,以测试它们激发免疫反应的能力。这些能激发免疫发应的TAAs包括黑色素瘤抗原mTRP-2 [62,63] 和MART-1 [64]。也研究了肝细胞瘤抗原,包括Sca-2,GP38 和细胞的 RABP1 [65]。TAAserbB2 [66]和 PSCA [67]已经用于针对前列腺癌。所有这些LV转染的TAAs都能帮助引导DCs诱导特定的免疫反应,从而实现有效的肿瘤抑制。

LVs具有独特性质,使之成为用于转染DCs成为疫苗的有吸引力的病毒载体系统。就像以前提到的,它能够为分裂和未分裂细胞提供稳定基因传递,并且免疫毒性低。已经证明是不依赖包壳蛋白和假型但依赖细胞的进入,LV转染激活DCs,释放I型IFN和调节对携带抗原的免疫原性[60]。进一步发现这个作用是通过TLR依赖机制[61]。为了检测其激活免疫功能,利用转染多种TAA的DCs已用于前期临床的小鼠实验。一些TAAs能够引起免疫反应,包括黑色素瘤抗原mTRP-2[62,63]和MART-1[64]. 肝肿瘤TAAs也有研究,包括Sca-2, GP38和细胞RABP[65]. TAAs erB2[66]和PSCA[67]已经用于靶向前列腺癌。所有这些LV转染的TAAs能够帮助DCs诱导特异免疫反应,引起肿瘤明显抑制。

不论这种类型治疗的潜在疗效如何,DC疫苗仍有许多问题需要克服。基于DC的疫苗通常是自体的:在治疗之前,需要从每个患者身上采集DCs。然而,DCs在外周血中数量有限。有一种方法能够克服这个问题,就是通过分离CD14+单核细胞前体和CD34+血液或骨髓DC前体,加入细胞因子和生长因子的结合物使它们分化为成熟的树突细胞 [68-70]。自从这个方法使用以来,许多研究机构已经成功地用LV转染CD14+-CD34+-衍生的DCs,以产生高水平的转基因表达[71,72]。另一个正在探索的策略是利用来自人多功能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞[73,74诱导产生的DCs。人iPSCs已经从供体真皮纤维母细胞中通过LV转染了OCT3/4,SOX2,c-MYC 和 Klf4转基因重编程获到[73]。这些具有多种潜能和自我更新能力的iPSCs可以分化成有功能的DC,具备所需的表达谱、细胞形态和细胞因子,使它们有能力诱导抗原特异性T细胞反应[73]。DCs的这些功能将有助于大规模生产,使临床使用成为可能,并有可能帮助绕过目前存在的病人-病人的变异性和恢复的问题。

这种治疗方式面临的其他挑战包括体外用于制备疫苗的时间框架是有限。动力学研究表明,携带抗原的DC寿命是短暂的[75],这使得达到有效加工、抗原加载和成熟变得非常困难。通过使用LVs将c-FLIPS,c-FLIPL, Bcl-XL 和 M11L基因的cDNA 转染 DCs,我们已经成功地延长了DC的生存时间[76]。这些基因编码为生存因子,在内在和外在的细胞凋亡途径发挥作用。LVs的益处有助于促进DC疫苗提供并产生更强大的免疫反应,从而进一步延长患者生存期。

体外疫苗接种研究的成功激发了对LVs携带TAAcDNA序列直接免疫的评估。小鼠皮下注射LVs可引起由皮肤衍生的DCs来直接诱发[77]。然后,这些DCs游向淋巴结,诱导T细胞的反应,并产生长期的抗肿瘤免疫。研究还显示,在小鼠肌肉内和腹腔内注射LVs也能产生有效的免疫反应[78,79]。这种策略比上文所述的体外转染概念上存在更多的突变风险,但可能能够绕开DC苗的一些后续限制,包括需要每例每人都要进行分离和扩增细胞。更多的研究需要对直接注射LVs作为一种肿瘤免疫接种方法来评价其治疗潜力和安全性。

 

肿瘤细胞疫苗

专业性抗原提呈细胞(APCs),如DCs和B细胞,会被用于提呈免疫系统识别的TAA。它们也能为T细胞提供各种各样的共刺激作用,如诱导特异抗癌T细胞应答。然而,成熟树突细胞的生成可能是困难的,需要资源强化,及大量的细胞因子。一项上面提到的技术变化是用共刺激因子和/或细胞因子把癌症细胞转染成为自体疫苗。这项技术利用了在癌细胞中可能已经有表达各种各样的TAAs。通过在癌症细胞中加入共刺激结构域,激活针对一些癌细胞抗原的辅助性T淋巴细胞(Th1)反应(见图1C)。这样可激活细胞毒性淋巴细胞(CTL)有选择性地靶向和清除肿瘤细胞。某些形式的白血病是发展疫苗的好选项,因为它们表达MHC1和MHC2(主要组织相溶性复合体1、2)分子以及TAAs,但缺少共刺激蛋白[80]。这意味着白血病细胞有潜在信号让免疫细胞区分白血病细胞和健康细胞,但缺少激活免疫系统的共刺激结构域。因此,通过增入免疫系统的共刺激结构域和/或细胞因子成份,使白血病细胞可以转变成全细胞疫苗,预警和刺激免疫系统。结果引起T细胞胞增殖和攻击具有表达肿瘤样的TAA文谱的细胞。理想地话,它应该为病人提供对白血病的长期免疫。

白介素12(IL-12) 是一种 Th1趋化的细胞因子,当静脉注射IL-2在小鼠和人时,将产生所谓的抗白血病效果。这包括但不限于,T细胞介导的特异抗原的清除。在各种临床前的小鼠模型研究中,全身回输这种细胞因子取得了非常好的成功,说明对第二次注射的基因相似的肿瘤细胞可完全的清除甚至产生免疫 [81]。这一临床前成功实验已经带动了一期和二期临床试验。不幸的是,IL-12系统注射的二期临床试验已经显示在病人体内产生了严重的细胞毒性,而反应率低[82]。这个毒性是由于次级细胞因子的产生,γ干扰素(IFN-γ)和α肿瘤坏死因子(TNF-α),趋化因子,干扰诱导因子10(IP-10)和结膜免疫球蛋白(MIG) [83,84]。在此基础上,研究表明白介素12(IL-12)的反应被抑制细胞因子白介素10(IL-10)所中和,并阻断系统性的辅助性T细胞(Th1)的趋化[85]。

传递IL-12的第二种方法是通过肿瘤细胞,即有效地将肿瘤细胞转化为肿瘤细胞疫苗。已经表明转染B7–1 和 IL-12的B细胞淋巴瘤,然后被注射到小鼠,可引起细胞因子趋化变化,使辅助性T淋巴细胞1(Th1)反应和诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性[86]。来自白血病的含有表达IL-12的白血病LV的癌症细胞疫苗,在小鼠模型中被用于对抗系统IL-2[87]。老鼠不仅能够排斥产生IL-12的白血病细胞,也能清除非转染的白血病细胞。所有注射修饰后表达IL-12细胞的小鼠都能存活一定时期,并有对白血病的长期保护作用。进一步来说,为了获得这样的生存期和长期免疫的目的,需要注射至少0.2%的白血病细胞种群和能高水平地产出IL-12。最后,这种细胞介导的治疗证实没有看到IL-10的提高。很可能是, 局部控制IL-12释放到微环境可消除了机体对其阻断作用的需要。

这种细胞介导的治疗方法应该也降低这种细胞因子治疗引起脱靶毒性,因为它是用T细胞介导的对特异肿瘤的反应,取代了简单地诱导所有T细胞的趋化反应。前面提到的治疗组已经证明了这种模式在实体瘤中有效性[88]。他们表明自体疫苗方法能够使小鼠获得排斥实体瘤并维持长期免疫的能力。在这项研究中,在以IL-12为基础的治疗中,肿瘤浸润淋巴细胞的数量也增加了。

许多其他LV全细胞抗瘤疫苗已经开发并在临床试验中。例如,在急性粒细胞白血病(AML)细胞中转入CD80和GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-群刺激因子),GM-CSF是一种能刺激巨噬细胞生产和DC浸润的炎症性细胞因子。这样使DCs表达抗原,反过来,促进T细胞扩增和抗肿瘤反应[89]。另一个全细胞疫苗,是用LVs把CD80和IL-2 cDNAs 转染到急性髓细胞白血病(AML)细胞中[90]。 IL-2是一种Th1趋化性细胞因子,与IL-12非常相似,但更倾向CTL而不是一种抗体反应。推测能产生更强的肿瘤免疫反应。像IL-12一样,IL-2被体内转入用于癌症治疗,但它的毒性问题也被发现[91]。

 

人工抗原提呈细胞(aAPCs)

人工抗原提呈细胞(aAPCs)是另一种肿瘤免疫治疗形式,它采用了LV传递基因的实效性。这些aAPCs用于促进T细胞的体外扩增。aAPCs发挥作用一般是在细胞表面或磁性微珠上表达共刺激结构域和TAAs。LVs能用于把白血病细胞转换成aAPCs,方法是将表达共刺激分子或细胞因子的LVs转染到细胞中。当白血病细胞在其表面能提呈各种TAAs时, aAPCs可以设定为特定的分子来允许适当的T细胞激活和增殖。

白血病细胞系K562,通过LV转染CD80和/或4-1BBL载体后,可被转换成aAPCs [92]。在不需要外源的细胞因子的情况下,这些aAPCs有能力支持T细胞的体外生长和长期扩增。CD80表达在激活的抗原提呈细胞(APCs)、B细胞和单核细胞上,并为T细胞提供共刺激信号,促进活性和生存。4-1BBL表达在DCs的表面上 ,代表一个共刺激结构域,功能在于增强T细胞增殖、细胞因子分泌和溶解细胞能力。进一步研究者展示了他们的K562 CD80+4-1BBL+ 的aAPCs能使CD8+ T细胞体外扩增大约10,000倍,包括已经基因改造的T细胞[92]。其他体外扩增方法,如微珠或其他aAPCs,也近十几倍。这种方法有助于克服自体T细胞疗法面临的最大问题之一:有限的靶向效应细胞的体外扩增数量。值得注意的是,这也引发了一种在过继性免疫治疗中很重要的多克隆T细胞扩增,这有利于效应功能和特异性之间的平衡。

 

过继T细胞

由于近期临床上取得的成功,过继回输基因修饰T细胞走到了癌症免疫治疗的前沿。相比其他免疫治疗,T细胞治疗的优势之一是能找到肿瘤的原发部位。T细胞一旦到达肿瘤部位,经TAAs的特异性刺激而增殖、保留并攻击肿瘤细胞。自体T细胞治疗通常包括采集病人的T细胞,然后筛选出活性良好、并且与所选抗原有亲和力的T细胞。接着激活、扩增这些细胞,并再回输给病人。尽管客观临床反应已有报道,这类治疗还面临许多问题,包括缺乏天然存在的抗原特异性T细胞、无力打破肿瘤耐受性,以及扩增这些细胞到足够数量的难度。一些基于转基因的修饰方案已经能够对付这些问题。T细胞经特定修饰后,使他们增强了识别、增殖、并扼杀特定肿瘤细胞的能力。这方面将涉及用于T细胞的基因修饰方法,包括利用重组LVs对T细胞的异源TCRs和嵌入抗原受体进行加工修饰。

 

T细胞受体

T细胞受体(TCRs)是由一个α 链和 一个β链组成的异二聚体结构,能识别主要组织相溶性复合体(MHC)加工的细胞内蛋白。当TCR受刺激时,TCR与CD3信号复合体相关联而激活T细胞。由于TCR基因能从T细胞群体分离出来并转移到其他群体中[93],因此发展了一个治疗策略,从对特异TAA具有高度特异性和活性度的T细胞中取出TCR基因,传递这些cDNAs到采自病人的外周血T细胞中(图1B)。在这个表征里,TCR的转染期待能获得高度的肿瘤反应活性和特异性。开发重组病毒载体,帮助稳定和高效的基因传递,使这种治疗策略成为有可开展的治疗。

双顺反子LVs的发展是一个创新。这实现了更容易表达TCR复合物的α和β基因。反过来,已经使LVs成为表达TCR基因治疗的载体选择[94]。多项用LV 把TCR转染给自体的T细胞治疗针对不同肿瘤的临床试验正在进行中,有靶向NY-ESO-1治疗食管癌临床II期试验[95]。还有各种试验靶向转移黑色素瘤的MART-1,如多个临床实验靶向MART-1,结合自体TCR靶向MART-1与和负载MART-1的DCs的I期联合临床试验[96]。

TCR治疗面临的一个潜在问题是,外源性TCR链和内源性TCR链结合产生的脱靶毒性,导致不希望的异源性TCR形成[97]。解除这个潜在问题的方法,就是利用设计好的核酸酶来清除内源性基因。ZFNs靶向TCR基因能够有效地阻断TCR在细胞中的表达[30]。相比未编辑的T细胞,ZFN-编辑的T细胞,LV转染的Wilms 肿瘤蛋白1特异性的TCR已经具有明显的纯度和低脱靶毒性[30]。这显示了TCR治疗的安全性和有效性具有更多的发展应用前景。

 

嵌合抗原受体(CARs)

最近CAR-T在治疗CD19+的B细胞恶性肿瘤取得的成功,让CARs变得很流行[89,99]。在美国,有20多项用CD19CAR-T细胞治疗各种B细胞恶性肿瘤的临床试验正在进行中或已完成。也许多CARs针对其他实体和血液癌症的TAAs。这些临床前和临床研究正在使用了几个基因转递系统,包括γ逆转录病毒和LVs。

     典型的CARs用法是通过用CAR序列体外转染病人的T细胞作为自体T细胞治疗。顾名思义,CARs由几个不同的域组成,它们衍生自特定的蛋白并被组装成一个人工受体。这些受体被设计成保留在细胞膜上,它们包含细胞外域和细胞内域。细胞外区域可与特定的在肿瘤细胞表面表达的TAA相结合。该区域通常由来自抗体的单链可变片段(scFv)组成,它能识别并结合特定的TAA,将免疫细胞特异性靶向目标癌细胞(图 1A)。细胞内结构域的数量是在1到3个,用于激活或增强T细胞的细胞能力。细胞内结构域也具有细胞因子的分泌、增殖和维持效应细胞功能的作用[100,101]。这些结构域典型的包括来自TCR的CD3ζ[102],以及CD28, OX40 和/或 4-1BB。一般来说,为了直接产生获得性免疫反应,CARs 已经被转染进入CTLs。然而,利用其他细胞,如NK细胞,也正被研究并显示出潜在的优势[103]。

 CAR-T细胞,像其他治疗一样仍然有其自己的局限性。因为CARs一般都有来自鼠源抗体轻链和重链的胞外域,它们可能具有潜在的免疫原性。这有可能使他们被机体清除出去,去除其治疗的效能。此外,即使它们是用人源化抗体修饰,它们仍然是可能产生免疫反应的新型融合多肽。进一步说,CARs只能识别细胞外表达的TAAs,相反,TCRs作用MHC处理后的蛋白,这些蛋白可以是胞内的。虽然这在一定程度上限制了CAR治疗的潜在靶点,MHC的独立性是一个重要的优点,因为癌症通常能够通过沉默MHC表达来逃避免疫监视。进而在这些方面,TCRs与内源性TCRs以二聚体和异源的二聚体形式工作,会导致非期望的脱靶效应。如上面所提到的,在与TCR疗法结合治疗中,ZFNs已经显示出了减少非期望的脱靶毒性的潜在价值。

    CAR 疗法也与一些风险有关。增强的免疫反应成为一个疗法后的结果。这一结果会导致细胞因子风暴:一种不可控的系统性各种细胞因子升高。细胞因子风暴,也称为细胞因子释放综合症(CRS),按严重程度上表现不同,可从发烧,到器官衰竭甚至死亡,因此使之成为一个非常紧急地事件需要说明。也就是说,这样的反应更像机体条件性移植反应规则重新回到病人身上,而不是CAR修饰的T细胞本身[104]。一种用于防止发生CRS的方法就是上面讨论的激活控制细胞命运或自杀系统。通过一个iCasp9系统诱导细胞凋亡方案已经在临床上成功地终止同种异体干细胞移植反应和迅速逆转移植物抗宿主疾病(GVHD)[105]。就如我们实验室开发的dCK和TMPK系统,这个系统和HSV-TK系统可以应用到CAR和TCR T细胞的治疗中。 将效应序列与治疗基因转染到细胞,可在应用前体药时终止细胞治疗,防止对CRS正反馈系统的发展和其他潜在不良反应。

另一个关注点,是转基因修饰的T细胞的脱靶性结合引起的中靶效应。这个问题高度依赖TAA和scFv。通常选用TAAs是由于它们在癌细胞中过表达。然而,因为TAAs是自体抗原,所以在正常组织中也会有低水平的表达。发生的原因是这些抗原的存在提供了生存优势或是由于起源于共同的多功能前体细胞。例如CD19高水平表达在B细胞恶性肿瘤,但在健康的B细胞中也有表达。结果,B细胞缺乏成了CAR治疗的副作用。在这种情况下,相对B细胞短期缺失的后果,接受治疗的病人延长生存期更有价值。因此,选择适当的TAA对CAR治疗成功是至关重要的。

随着对CAR疗法的疗效和减少其脱靶效应的需要增加,进一步的研究需要鉴定新的TAAs和精细调整CAR治疗适当的亲和力和持续时间。还需要应用这种治疗到实体瘤,扩大这一治疗到其他肿瘤类型。尽管这里的一个问题是找到靶向肿瘤细胞。目前的一些研究已经在探索通过 信使核糖核酸(mRNA)电穿孔转染CARs的可能性,而不是用病毒载体来传递[106]。这将引起大大降低CAR表达的周期,防止长期的CRS反应和/或限制了脱靶肿瘤效应。然而,为了诱导这一反应,也需要多重方式的CAR细胞回输。不幸的是,已经发现多重方式回输伴随着副作用例如过敏反应增加的风险[117]。用病毒载体LV实现的长期表达的好处是一次回输CAR修饰细胞就可以获得明显的治疗效果和对癌症复发和进展的长期保护作用。

 

 

结论和展望

在过去的几年里,重组LVs在基因治疗和癌症免疫治疗应用中的增加。有效且稳定的传递能力以及感染非分裂细胞特性,使LVs 有别于其他整合的病毒系统。虽然安全性(主要是插入部分的基因突变)仍然是大家关心的内容。LVs 已经用于广泛的肿瘤治疗,包括但不仅限于,DC和癌细胞疫苗,TCR和CAR基因修饰T细胞治疗。现在为止,一些免疫治疗已经在临床上取得了成功,更多的成果将接踵而至。

 

 

财务与竞争利益的披露

奥尔德姆(RAA Oldham)受到加大拿大卫生研究院,加拿大研究生硕士奖(CIHR CGS Master奖)和MBP卓越UTF奖学金的支持。贝琳斯丁(EMBerinstein)受到了安大略省学生创业信托基金奖(Ontario Student OpportunityTrust Fund Award)和UTF MBP卓越奖学金。除了这些披露,作者没有其他附属或财务上与任何机构或财政利益团体在本课题或本文所讨论的内容方面有任何关系。

 

编译者钱武东,李忠。译自《免疫治疗》2015, 7(3):271-284

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在肿瘤免疫治疗中的慢病毒载体

Robyn AA Oldhan, Elliot M Berinstein, Jeffrey A Medin

 

概要

慢病毒载体提供有效的和可能的基因传递的安全系统

慢病毒载体(LVs)来自复杂的逆转录病毒,具有传染非分裂细胞的能力。

基因整合特性允许长期、稳定转基因表达。

与γ逆转录病毒相比,LVs具有较低的插入突变倾向。

为了增大LVs的安全性,补偿性改变已进行  

第三代基因封装系统和自失活载体可达到止防止慢病毒复制形成的目的。

利用异体的不强增强子功能的启动因子可降低了插入突变频次。

细胞命运控制安全系统允许靶向清除LV转染细胞  

例如常规的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的自杀系统,用于接受治疗的病人,能选择性清除转染细胞。

新系统,如dCK 和  TMPK,寻求避免与HSV-TK相关问题,如免疫源性和无效药物前体转换引起的不完全杀灭。  

肿瘤疫苗

用LV转染改进了DC疫苗:通过提供更稳定更天然的抗原提呈表达机制、帮助制备有效的、可替代的DC前体细胞、延长DC在体外寿命。

LV与共刺激结构域和/或细胞因子转染肿瘤细胞有助于诱导肿瘤特异性免疫反应并保存持续性免疫。

过继T细胞治疗

具有高度亲和力和活性的T细胞受体并能趋向特异性肿瘤已经被亚克隆到病人的T细胞中,使其产生特异性的抗肿瘤T细胞反应。 

双顺子的LVs开发帮助提供了稳定和有效的T细胞受体双链基因的传递。

嵌入抗原受体通过LV转染使免疫细胞具备了选择识别和杀灭癌症细胞的能力。

结论

在癌症免疫治疗中应用LVs是一个不断扩大的领域。

LVs可直接用于转染肿瘤细胞产生抗肿瘤作用或使免疫细胞强大而产生特异的、增强的抗肿瘤反应。

 

 
 

基础科学在癌症免疫治疗的进展已经使各种治疗方法在临床上取得了成功。很多疗法需要将基因插入细胞中,直接杀死目标细胞或重新引起宿主细胞产生强烈地免疫反应。其他类似的治疗方法是通过修饰效应细胞来改善靶向性和增强对肿瘤细胞的杀伤力。最初使用γ逆转录病毒的研究显示了很好的前景,但是对插入突变的潜在安全考虑强化了人们开发基因传递技术的欲望。慢病毒载体(Lentiviral vectors, LVs)被认为是潜在的更有效和更安全的转递载体。LVs已经被用于许多不同类型的遗传和后天疾病包括癌症的临床试验。本文将讨论目前我们对LVs的认识,以及基于病毒载体传递在癌症免疫疗法中的应用。

 
 

关键词:癌症,细胞命运控制系统,细胞免疫,嵌合抗原受体,细胞因子,树突细胞,免疫治疗,慢病毒,T细胞,转基因

 
 

癌症免疫疗法是指为了清除肿瘤细胞而利用免疫系统的治疗方法。体内的免疫细胞本来已拥有识别和攻击恶性肿瘤的机制; 然而,肿瘤细胞经常采取对抗这些机制的措施,致使其失效。免疫疗法通过各种不同的方法寻求增强和补偿这些正常反应,包括抗体和细胞因子疗法,癌症疫苗和过继细胞输入。无论是直接杀灭、诱发免疫反应或者提高免疫细胞的靶向性和细胞毒性,这些治疗方法都要求对病患细胞进行基因修饰。为了使这些基因疗法在临床中切实可行,必须要有一套能安全和有效地传递基因的可靠方法。迄今为止,许多不同的方法已经在研究和测试。

 

用重组γ逆转录病毒(akaoncoretrovirus,也称致癌逆转录病毒)把一个特定的T细胞受体转入淋巴细胞用于治疗黑素瘤,是第一个探索从改造免疫细胞基因实现癌症免疫治疗的临床试验。这项工作自2006年公开发表以后,利用各种基因传递方法探索了许多不同的癌症免疫治疗方法。一些病毒和非病毒式的系统现在已经应用。重组γ(Gamma)逆转录病毒仍然是一个常见的选择;然而,慢病毒载体(LVs)成为另一种潜在的、更有效和更安全的选择已经出现。到2014年1月,γ(Gamma)逆转录病毒被用于19.2%的基因治疗试验[2]。但目前,在所有公开和以往试验中,LVs只占3.5%,然而,这个数字正在增加[2]。

 

其他常用的病毒基因传递方式包括重组腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)。腺病毒载体表达滴度较高,但是可引起不良的免疫反应,并且不整合到宿主基因组中限制了基因表达的持久性[3]。已知野生型AAV更倾向整合至基因组的一个位点,但是重组AAV的整合并不在可预知的效率[4]。此外,AAV载体容量较小,限制了其传递基因的大小[5]。γ逆转录病毒和LVs都能够有效地将它们的DNA插入宿主基因组中,从而使转基因产品得以稳定和长期的表达。这有助于确保最大的治疗效果,这也是为什么这些载体经常被选择用于针对癌症免疫疗法的原因之一。

 

慢病毒生物学与生命周期

LVs属于逆转录病毒科,但它们比γ逆转录病毒拥有更复杂的基因组。所有逆转录病毒都包含病毒感染和复制所需的基本基因组。这些包括编码结构蛋白的gag基因、编码酶蛋白的pol基因,和编码包壳糖蛋白的env基因。LVs也具有病毒复制需要基因rev和tat,和辅助基因vif,vpr,vpu和nef。这些辅助基因的功可见Malim和Emerman发表的综述[6[。结构蛋白对于环绕病毒颗粒核心RNA的包装性结构序列是必不可少的。病毒核心包含两套完全相同的RNA与酶蛋白整合酶,逆转录酶和蛋白酶,与核衣壳蛋白形成复合体[7]。从外面到核心是与脂质膜的外层相互作用的基质蛋白质层。env基因编码的糖蛋白镶嵌在外层。

病毒感染启始于env编码的糖蛋白与细胞膜上的受体结合。在LV介导的基因治疗应用,最常用的包壳蛋白是来自疱疹性口炎病毒的糖蛋白,它通过与低密度脂蛋白(LDL)受体和类似的家族成员结合使病毒具有一种广泛的亲向性[8]。这个结合可让病毒与细胞融合,然后病毒的内容被传送到细胞内部。一旦进入,病毒就会脱壳,病毒核心成分释放到细胞质中。这包括单链RNA基因组,再转化为cDNA,转移到细胞核。在γ逆转录病毒感染过程中,细胞必须在病毒DNA进入细胞核之前进行分裂(也就是核膜的溶解)。另一方面,LVs,还有其他的特性,包括中心DNA活瓣和其他不确定因素,允许病毒DNA通过完整的核膜传递[9]。γ逆转录病毒和LVs两者都将它们(现在的双链)DNA整合到宿主基因组中,然后利用宿主基因组机制将它们的基因转录到RNA上。一旦来自野生型逆转录病毒的RNA复制并回到细胞质中,就被翻译并包装进一个新的病毒粒子,它将会从细胞芽胞释放,完成生命周期[10]。

 

 

 

慢病毒介导的基因传递安全性的发展历程

慢病毒转递系统

在基因疗法中,为了使安全性最大化,人们对LV基因组进行了许多改造。这些改变被分为三次迭代。在当前的第三代系统中,病毒基因组成份被分散进入一种包装质粒、一个转递质粒和一个包壳质粒,再转染进HEK 293T细胞进行病毒生产。包装质粒含有在病毒生产中转染所需要的所有元素。这包括结构基因,酶蛋白质gag,pol,以及病毒调控基因rev。另一种情况,rev可被第二个包装质粒来表达形成四质粒系统。传递质粒含感兴趣的基因和必要的顺式调控元件,比如Ψ (psi)RNA包装信号,3'和修饰的5’LTR元件[11]。这个修改过的5'LTR用有活性的tat独立启动子替换了内源性HIV启动子,允许tat基因不在包装质粒上[12]。env编码蛋白在一个分开的质粒中被表达出来,这样可以改变病毒的亲和性,也称为假性配型。这种多质粒系统保证了在随后的转染中只保存感兴趣的转基因和顺式作用序列。一些不必要的病毒蛋白,如辅助蛋白,被一起被忽略,这样有助于降低免疫原性[13],而删除这些编码序列进一步降低重组导致可复制潜能的慢病毒产生的可能性。

在第二代和第三代系统中,有了进一步安全方面的改进,包括自身失活的转染载体的开发。这是通过把转染载体的3′LTR的U3部位删除实现的,在逆转录和整合之后被转移到5'LTR,使LTR启动子活性有效地减少[14,15]。此外,这个删除没有根本性影响病毒的滴度,又减少了启动子的干扰,因为启动子干扰可能导致不良的转基因沉默。病毒基因分裂成不同的质粒,以及自灭活转染载体的使用,进一步降低了有复制能力的慢病毒产生的可能性。

其他优化载体的方法也进行了研究,包括中央多嘌呤片段的插入,可其改善预整合复合体的核内转运 [16],及土拨鼠乙肝病毒转录后调控元素,后者在促进转基因方面发挥作用[17]。这些特性协同工作以提高转染效率和转基因表达[18]。细胞特异性或诱导型启动子也是很有用的工具。细胞特异的启动子或组织特异的启动子,可靶向转基因在特异组织表达,例如肿瘤细胞,目的是减少脱靶效应。另外,诱导型启动子,通过服用抗生素如四环素,可以在需要的时候打开或关闭基因表达[19]。在癌症免疫疗法的背景下,免疫细胞可根据需要携带整合原病毒来提供抗癌治疗,但是降低持续转基因表达有助于减少不良副作用。

插入突变的风险

不论对基因传递系统怎样改造和优化,对LV安全性的担忧仍然存在。担忧主要在于插入基因发生突变的潜在风险。第一种明确的成功的利用γ逆转录酶病毒的基因治疗,是针对儿童重症联合免疫缺陷疾病(SCID-X1)[20]。不幸的是,基因治疗后,许多病人发生了白血病。逆转录病毒生命周期的基因组整合步骤是一种非定向插入,因此,有机会整合进一个调节生长的位点。可能发生前病毒插入的一些“热点”已经证实。为了评估插入突变的相关风险,Cattoglio等人在2007年进行的一项研究中,绘制了LV和γ逆转录病毒感染CD34+造血细胞的“热点”图。γ逆转录病毒在“热点”中插入的机率大约21%,并常见在原癌基因和生长控制基因[21]。而LVs插入热点的机率较小,大约有8% ,并且不在原癌基因和生长控制基因[21]。在LV转染进骨髓细胞[22]和肝细胞[23]的体内研究中,发现前病毒插入主要发生在有活性的基因中,插入部位不在与生长有关的基因。此外,LV感染后没有观察到克隆性扩张[22,23],提示载体诱导肿瘤发生的风险很低。到目前为止,这项工作支持重组的LVs相对于修饰后的γ逆转录病毒更安全的推论。

设计的核酸酶

另外一种已经在研究的处理插入引起突变潜在问题的方法是开发非整合的慢病毒载体(NILVs) [24]。具体地说,整合酶基因蛋白的点变化阻止了基因组整合;换句话说,含有转基因的质粒仍然游离地保留在细胞核中[25]。这种策略产生的转基因表达比整合载体更低,而且是瞬时表达转基因[26]。这项技术进一步允许NILV DNA通过使用锌指核酸酶(ZFNs)在一个特定的目标靶点上进行同源重组,而产生双链断裂来启动同源修复通路[27]。

这个方法允许对基因序列进行靶向校正,以降低插入突变的风险。转录激活样效应核酸酶(TALENs)在功能上类似于锌指酶(ZFNs),但是其DNA识别域的设计更简单,也更灵活。最近发表的一项研究,报告了靶向人类蛋白质编码基因的18740个TALENs构建情况[28]。临床前研究表明,NILVs已经被证明在癌症免疫疗法里是有用的。它们已经被单独应用,比如利用NILVs做癌症疫苗[29],以及与设计者核酸酶结合,就像在T细胞里结合锌指酶(ZFNs)表达肿瘤特异性T细胞受体(TCRs),从而干扰内源性TCR基因以增加其效力和安全性[30]。

基因组编辑系统 CRISPR/Cas 是最近开发的另一种实施特定位点双链断裂方法;该系统利用RNA分子标识切割位点并由Cas核酸酶切割[31]。在小鼠胚胎干细胞使用LVs和CRISPR系统实现定点诱变的功能缺失筛选,其方法比RNAi 更有效地抑制基因表达[32]。LVs和人类细胞的研究也已完成,在2013年吉尔伯特等将失活的Cas9与调控蛋白融合,依靠RNA引导实现基因的定向抑制或激活。在转染14天后,CRISPR/Cas转基因仍能继续稳定表达[33]。   

虽然上述的技术前景广阔且肯定在进一步发展,有一些问题需要克服。由于同一或同源的DNA序列而导致的脱靶突变是ZFN和TALEN系统的一种风险,crispr/cas系统甚或风险更大[34]。为了解决这个问题,仔细地选择靶位点和控制CRISPR/Cas剂量有益于减少风险[35,36]。其他选项,例如转换Cas9到切割酶的方法也正在研究[37]。ZFN切割酶的开发已经被报道[38–40]。这个系统的效率也在优化中。就CRISPR/Cas来说,下游间区序列邻近基序(PAM)需要限制了靶向的位点,因此开发一个间区序列邻近基序的独立系统是有益的。这些系统在原代细胞中的效率是另外一个妨碍其广泛使用的问题。最后,这些系统的转递模式还在开发中。因为大的转基因是病毒转染系统的一个限制因素,因为传递系统有大小限制。LVs可能对ZFN and CRISPR/Cas系统是个可行的选项,但对TALENs已经被证实是不相容,原因在于在转基因传递之后高度重复的TALEN序列的趋向于重新排列[41]。因此,进一步开发转基因交付技术将至关重要。

细胞命运控制安全元件(自杀机制)

细胞或基因治疗产品应用后可能会发生的副作用,细胞命运控制(也称为自杀机制)元件提供了一个缓解办法。这个方法涉及加入转基因序列,允许选择性地清除已用于病人身上的转基因细胞。这些系统通常是基于一种酶的特殊的突变形式,与细胞治疗序列一起转入靶细胞。这些被改变的酶使细胞具有能将一种无毒药前体转化为一种细胞毒性化合物,最终清除靶细胞。

传统的单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) cDNA是一个广泛使用的自杀系统,包括转换更昔洛韦(GCV)前体药成细胞毒性的更昔洛韦-三磷酸盐(GCV-TP)[42]。这个系统已经在临床试验取得成功。然而,靶细胞的消除并不总是完全有效。这可能是由于GVC-TP细胞毒性依赖于细胞周期的,因此是非分裂细胞是不受影响的。这可能是因为底物动力学活力不够和或有限转换过程的重新定位,到下一个途径中的酶(鸟苷酸激酶)是有问题的。这个不完全根除导致病人面对剩余的负作用。此外,GCV经常用于干细胞移植患者,作为一种预防药治疗机会性巨细胞病毒感染,由此,从清除疗法中排除了部分患者涉及安全系统的问题[43]。这个系统的免疫原性是第三个关心的问题。HSV-TK基因产品是病毒起原的,因此,它会在转染细胞中的存在通过宿主免疫系统在产生积极的效果之前引起它们的清除[44]。

为了应对与HSV-TK相关的缺陷,我们实验室开发了两套新的细胞命运控制系统。它们被称为TMPK[45]和dCK[46]。两个系统都是基于对人类酶的最小修饰,因此预计只会在病人中产生较低的免疫原性。此外,它们能以良好的安全性能与相关的动力学激活前体药。改变后的TMPK有能力激活前体药叠氮胸苷,成为有毒的叠氮胸苷三磷酸盐,从而导致细胞凋亡。这是在TMPK突变表达的细胞中通过降低线粒体内膜电位和caspase-3的激活来实现的[45].此外,我们近来也证明了突变的TMPK可以被有效地与细胞表面标志融合在一起,因此,载体滴度和跟踪功能与之相结合来达到根除的目的[47]。我们实验室开发的第二个系统是基于人类的脱氧胞苷激酶(dCK)。这种酶在核苷酸合成的补救途径中是必不可少的激酶。dCK的突变体被设计成含有多个活性的位点,这些位点允许酶去激活多种与临床相关的前体药,但是我们的工作主要集中在两个方面:BVdU和LdT[46]。这个系统是非常有选择性的,因为是野生型的dCK对这些化合物的转换不理想。此外,由于有多种前体药可用选择,也可以在根据不同病人上选择适当的效应化合物。

LVs在癌症免疫疗法的应用

免疫系统的操控,尤其是细胞免疫,正在成为抗癌一个重要的策略。考虑到这个研究/治疗领域里多样性的历史,不管是感知还是现实,真正的重生目前都正在发生。成功的治疗方法通常是两方面的:给免疫系统提供肿瘤相关靶点来识别;改造法去激活或者重定向宿主的免疫反应。在这里,我们将综述一下LVs是如何被用于癌细胞和免疫细胞的基因修饰,以起动和促进癌症免疫治疗。

 

 

癌症疫苗

树突状细胞疫苗

多种的策略已经应用于抗癌疫苗开发。他们的主要目标是刺激Th1的反应,包括细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),有选择性地靶向和消灭癌症。一类注定有利于促进抗癌疫苗治疗的细胞是树突状细胞(DCs)。DCs是专职的抗原提呈细胞,通过MHC-I、II获取、加工并向T细胞抗原。在这一过程中,DCs可以诱导特异性的Th1反应,包含CTLs。树突状细胞(DCs)受到炎症信号的刺激时,迅速成熟,加工和提呈抗原,并迁移到次级淋巴器官去引发免疫反应[48]。制备疫苗在某些方面可采集患者的树突细胞,接着在体外加载肿瘤相关抗原(TAA)。改造后细胞然后被回输给病人。这些负载的DCs有能力将处理过的TAAs提呈给T细胞,诱导Th1对表达TAA的细胞反应[49](见附图1D)。事实上,到目前为止,唯一经美国食品药品管理局批准的细胞调控免疫疗法是DC癌症疫苗,Sipuleucel-T。Sipuleucel-T治疗是向患者的DCs加载前列腺酸性磷酸酶(一种前列腺癌TAA)多肽和GM-CSF [50]来进行的。GM-CSF 是一种刺激巨噬细胞增殖和树突状细胞渗透的炎症细胞因子。这种组合成功地诱发了免疫反应,已经被证明可以延长患者的生命期平均为4个月。

 然而,以加载多肽为特征的DC疫苗疗法也面临几个障碍。体外将肿瘤抗原加在MHC是很短暂,阻止了长期的免疫效果。此外,这个反应是MHC单倍型的依赖,因此需要针对每一个病人进行个性化定制。此外,选择加载MHC复合体的特异肽序列是困难的,需要这个领域的研究继续优化这个选择过程。一个克服这些障碍的办法是用病毒载体携带完整的TAA cDNA去转染DCs[51]。已经证明了肿瘤抗原稳定表达,保证DC在免疫系统中以更自然的方式和在一个较长时间能处理和提呈抗原。

 

                  

图1. 慢病毒载体在肿瘤免疫治疗中的应用。CAR:Chimeric     antigen receptor; LV: Lentiviral vector; TAA: Tumor-associated antigen;     TCR: T-cell receptor

 

如上所述,DCs通过MHCs向T细胞的TCR显示处理过的抗原肽。然而,这个信号可能还不足以诱发T细胞反应。相反,已经表明这种相互作用可以独自导致T细胞失能和死亡[52]。在这种相互作用的基础上,更多的共剌激信号作为激活特性的免疫突触是诱导适当的细胞毒性T细胞反应所需要的[53]。细胞因子作为第三个信号帮助刺激和趋化细胞反应[54]。LVs用于加载DCs、激活它们的共同刺激信号,和/或者为了趋化T细胞释放特定的细胞因子。已经证明了,利用LVs可抑制DCs表面抑制性共刺激结构域PD-L1,可以加速抗肿瘤免疫反应[55]。此外,已经显示,用sPD-1或sPD-L1修饰DCs,以释放来干扰在免疫突触相互作用引起的CD80表达上调,一个共同刺激结构域激活和一个分别增高的肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素10(IL-10)细胞因子谱[56]。PD-1抑制剂已经显示可阻断T细胞抑制共刺激结构域,加速激活的DC中的抗肿瘤免疫反应[57]。另一种策略是使用LVs调节细胞内的通路。LVs修饰DCs 表达在p38 MAPK通路上的活跃蛋白,成功地增强抗肿瘤T细胞反应,延长荷瘤老鼠的存活时间[58]。在这项研究中,作者展示了激活p38导致上调共刺激结构域CD80、CD40和ICAM-I,帮助DCs诱发抗肿瘤T细胞反应[58]。许多增强DC疫苗的抗肿瘤潜力的策略正在探索中。

病毒载体也可以添加来自病毒蛋白的共刺激信号。这些共刺激信号可以帮助诱发免疫反应。例如,我们的实验室显示了Ad转染的DCs与LV转染的DCs相比有不同的免疫反应,当两者都表达HER/2抗原时[59]。Ad转染的DCs刺激CD4+和CD8+的T细胞反应,及强烈的体液反应。相反,LV转染DCs主要诱发的CD4+T细胞的反应,伴随着较高的IFN-γ分泌物浓度和较低的体液反应。这表明选择了病毒载体在DC疫苗引起的免疫反应中起着重要作用。因此,重要的是不仅要选择可靠的TAA,还要考虑最好的适合各个应用的传递载体。

正是LVs那些独特的品质,使它们可能成为有吸引力的病毒载体系统,把DCs转染成疫苗。如前所述,它们是有能力的在两种分裂和非分裂细胞中提供稳定的基因转移,具有较低的基因毒性系数。已经证明,LV转染独立于包膜伪型但依赖于细胞输入,LV转染激活DCs,释放1型干扰素(IFN),LV转染调制免疫原性去携带抗原[60]。进一步显示,这是通过TLR依赖机制发生的[61]。用LV进行各种TAAs转染的DCs已经在小鼠身上进行了临床试验,以测试它们激发免疫反应的能力。这些能激发免疫发应的TAAs包括黑色素瘤抗原mTRP-2 [62,63] 和MART-1 [64]。也研究了肝细胞瘤抗原,包括Sca-2,GP38 和细胞的 RABP1 [65]。TAAserbB2 [66]和 PSCA [67]已经用于针对前列腺癌。所有这些LV转染的TAAs都能帮助引导DCs诱导特定的免疫反应,从而实现有效的肿瘤抑制。

LVs具有独特性质,使之成为用于转染DCs成为疫苗的有吸引力的病毒载体系统。就像以前提到的,它能够为分裂和未分裂细胞提供稳定基因传递,并且免疫毒性低。已经证明是不依赖包壳蛋白和假型但依赖细胞的进入,LV转染激活DCs,释放I型IFN和调节对携带抗原的免疫原性[60]。进一步发现这个作用是通过TLR依赖机制[61]。为了检测其激活免疫功能,利用转染多种TAA的DCs已用于前期临床的小鼠实验。一些TAAs能够引起免疫反应,包括黑色素瘤抗原mTRP-2[62,63]和MART-1[64]. 肝肿瘤TAAs也有研究,包括Sca-2, GP38和细胞RABP[65]. TAAs erB2[66]和PSCA[67]已经用于靶向前列腺癌。所有这些LV转染的TAAs能够帮助DCs诱导特异免疫反应,引起肿瘤明显抑制。

不论这种类型治疗的潜在疗效如何,DC疫苗仍有许多问题需要克服。基于DC的疫苗通常是自体的:在治疗之前,需要从每个患者身上采集DCs。然而,DCs在外周血中数量有限。有一种方法能够克服这个问题,就是通过分离CD14+单核细胞前体和CD34+血液或骨髓DC前体,加入细胞因子和生长因子的结合物使它们分化为成熟的树突细胞 [68-70]。自从这个方法使用以来,许多研究机构已经成功地用LV转染CD14+-CD34+-衍生的DCs,以产生高水平的转基因表达[71,72]。另一个正在探索的策略是利用来自人多功能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞[73,74诱导产生的DCs。人iPSCs已经从供体真皮纤维母细胞中通过LV转染了OCT3/4,SOX2,c-MYC 和 Klf4转基因重编程获到[73]。这些具有多种潜能和自我更新能力的iPSCs可以分化成有功能的DC,具备所需的表达谱、细胞形态和细胞因子,使它们有能力诱导抗原特异性T细胞反应[73]。DCs的这些功能将有助于大规模生产,使临床使用成为可能,并有可能帮助绕过目前存在的病人-病人的变异性和恢复的问题。

这种治疗方式面临的其他挑战包括体外用于制备疫苗的时间框架是有限。动力学研究表明,携带抗原的DC寿命是短暂的[75],这使得达到有效加工、抗原加载和成熟变得非常困难。通过使用LVs将c-FLIPS,c-FLIPL, Bcl-XL 和 M11L基因的cDNA 转染 DCs,我们已经成功地延长了DC的生存时间[76]。这些基因编码为生存因子,在内在和外在的细胞凋亡途径发挥作用。LVs的益处有助于促进DC疫苗提供并产生更强大的免疫反应,从而进一步延长患者生存期。

体外疫苗接种研究的成功激发了对LVs携带TAAcDNA序列直接免疫的评估。小鼠皮下注射LVs可引起由皮肤衍生的DCs来直接诱发[77]。然后,这些DCs游向淋巴结,诱导T细胞的反应,并产生长期的抗肿瘤免疫。研究还显示,在小鼠肌肉内和腹腔内注射LVs也能产生有效的免疫反应[78,79]。这种策略比上文所述的体外转染概念上存在更多的突变风险,但可能能够绕开DC苗的一些后续限制,包括需要每例每人都要进行分离和扩增细胞。更多的研究需要对直接注射LVs作为一种肿瘤免疫接种方法来评价其治疗潜力和安全性。

 

肿瘤细胞疫苗

专业性抗原提呈细胞(APCs),如DCs和B细胞,会被用于提呈免疫系统识别的TAA。它们也能为T细胞提供各种各样的共刺激作用,如诱导特异抗癌T细胞应答。然而,成熟树突细胞的生成可能是困难的,需要资源强化,及大量的细胞因子。一项上面提到的技术变化是用共刺激因子和/或细胞因子把癌症细胞转染成为自体疫苗。这项技术利用了在癌细胞中可能已经有表达各种各样的TAAs。通过在癌症细胞中加入共刺激结构域,激活针对一些癌细胞抗原的辅助性T淋巴细胞(Th1)反应(见图1C)。这样可激活细胞毒性淋巴细胞(CTL)有选择性地靶向和清除肿瘤细胞。某些形式的白血病是发展疫苗的好选项,因为它们表达MHC1和MHC2(主要组织相溶性复合体1、2)分子以及TAAs,但缺少共刺激蛋白[80]。这意味着白血病细胞有潜在信号让免疫细胞区分白血病细胞和健康细胞,但缺少激活免疫系统的共刺激结构域。因此,通过增入免疫系统的共刺激结构域和/或细胞因子成份,使白血病细胞可以转变成全细胞疫苗,预警和刺激免疫系统。结果引起T细胞胞增殖和攻击具有表达肿瘤样的TAA文谱的细胞。理想地话,它应该为病人提供对白血病的长期免疫。

白介素12(IL-12) 是一种 Th1趋化的细胞因子,当静脉注射IL-2在小鼠和人时,将产生所谓的抗白血病效果。这包括但不限于,T细胞介导的特异抗原的清除。在各种临床前的小鼠模型研究中,全身回输这种细胞因子取得了非常好的成功,说明对第二次注射的基因相似的肿瘤细胞可完全的清除甚至产生免疫 [81]。这一临床前成功实验已经带动了一期和二期临床试验。不幸的是,IL-12系统注射的二期临床试验已经显示在病人体内产生了严重的细胞毒性,而反应率低[82]。这个毒性是由于次级细胞因子的产生,γ干扰素(IFN-γ)和α肿瘤坏死因子(TNF-α),趋化因子,干扰诱导因子10(IP-10)和结膜免疫球蛋白(MIG) [83,84]。在此基础上,研究表明白介素12(IL-12)的反应被抑制细胞因子白介素10(IL-10)所中和,并阻断系统性的辅助性T细胞(Th1)的趋化[85]。

传递IL-12的第二种方法是通过肿瘤细胞,即有效地将肿瘤细胞转化为肿瘤细胞疫苗。已经表明转染B7–1 和 IL-12的B细胞淋巴瘤,然后被注射到小鼠,可引起细胞因子趋化变化,使辅助性T淋巴细胞1(Th1)反应和诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性[86]。来自白血病的含有表达IL-12的白血病LV的癌症细胞疫苗,在小鼠模型中被用于对抗系统IL-2[87]。老鼠不仅能够排斥产生IL-12的白血病细胞,也能清除非转染的白血病细胞。所有注射修饰后表达IL-12细胞的小鼠都能存活一定时期,并有对白血病的长期保护作用。进一步来说,为了获得这样的生存期和长期免疫的目的,需要注射至少0.2%的白血病细胞种群和能高水平地产出IL-12。最后,这种细胞介导的治疗证实没有看到IL-10的提高。很可能是, 局部控制IL-12释放到微环境可消除了机体对其阻断作用的需要。

这种细胞介导的治疗方法应该也降低这种细胞因子治疗引起脱靶毒性,因为它是用T细胞介导的对特异肿瘤的反应,取代了简单地诱导所有T细胞的趋化反应。前面提到的治疗组已经证明了这种模式在实体瘤中有效性[88]。他们表明自体疫苗方法能够使小鼠获得排斥实体瘤并维持长期免疫的能力。在这项研究中,在以IL-12为基础的治疗中,肿瘤浸润淋巴细胞的数量也增加了。

许多其他LV全细胞抗瘤疫苗已经开发并在临床试验中。例如,在急性粒细胞白血病(AML)细胞中转入CD80和GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-群刺激因子),GM-CSF是一种能刺激巨噬细胞生产和DC浸润的炎症性细胞因子。这样使DCs表达抗原,反过来,促进T细胞扩增和抗肿瘤反应[89]。另一个全细胞疫苗,是用LVs把CD80和IL-2 cDNAs 转染到急性髓细胞白血病(AML)细胞中[90]。 IL-2是一种Th1趋化性细胞因子,与IL-12非常相似,但更倾向CTL而不是一种抗体反应。推测能产生更强的肿瘤免疫反应。像IL-12一样,IL-2被体内转入用于癌症治疗,但它的毒性问题也被发现[91]。

 

人工抗原提呈细胞(aAPCs)

人工抗原提呈细胞(aAPCs)是另一种肿瘤免疫治疗形式,它采用了LV传递基因的实效性。这些aAPCs用于促进T细胞的体外扩增。aAPCs发挥作用一般是在细胞表面或磁性微珠上表达共刺激结构域和TAAs。LVs能用于把白血病细胞转换成aAPCs,方法是将表达共刺激分子或细胞因子的LVs转染到细胞中。当白血病细胞在其表面能提呈各种TAAs时, aAPCs可以设定为特定的分子来允许适当的T细胞激活和增殖。

白血病细胞系K562,通过LV转染CD80和/或4-1BBL载体后,可被转换成aAPCs [92]。在不需要外源的细胞因子的情况下,这些aAPCs有能力支持T细胞的体外生长和长期扩增。CD80表达在激活的抗原提呈细胞(APCs)、B细胞和单核细胞上,并为T细胞提供共刺激信号,促进活性和生存。4-1BBL表达在DCs的表面上 ,代表一个共刺激结构域,功能在于增强T细胞增殖、细胞因子分泌和溶解细胞能力。进一步研究者展示了他们的K562 CD80+4-1BBL+ 的aAPCs能使CD8+ T细胞体外扩增大约10,000倍,包括已经基因改造的T细胞[92]。其他体外扩增方法,如微珠或其他aAPCs,也近十几倍。这种方法有助于克服自体T细胞疗法面临的最大问题之一:有限的靶向效应细胞的体外扩增数量。值得注意的是,这也引发了一种在过继性免疫治疗中很重要的多克隆T细胞扩增,这有利于效应功能和特异性之间的平衡。

 

过继T细胞

由于近期临床上取得的成功,过继回输基因修饰T细胞走到了癌症免疫治疗的前沿。相比其他免疫治疗,T细胞治疗的优势之一是能找到肿瘤的原发部位。T细胞一旦到达肿瘤部位,经TAAs的特异性刺激而增殖、保留并攻击肿瘤细胞。自体T细胞治疗通常包括采集病人的T细胞,然后筛选出活性良好、并且与所选抗原有亲和力的T细胞。接着激活、扩增这些细胞,并再回输给病人。尽管客观临床反应已有报道,这类治疗还面临许多问题,包括缺乏天然存在的抗原特异性T细胞、无力打破肿瘤耐受性,以及扩增这些细胞到足够数量的难度。一些基于转基因的修饰方案已经能够对付这些问题。T细胞经特定修饰后,使他们增强了识别、增殖、并扼杀特定肿瘤细胞的能力。这方面将涉及用于T细胞的基因修饰方法,包括利用重组LVs对T细胞的异源TCRs和嵌入抗原受体进行加工修饰。

 

T细胞受体

T细胞受体(TCRs)是由一个α 链和 一个β链组成的异二聚体结构,能识别主要组织相溶性复合体(MHC)加工的细胞内蛋白。当TCR受刺激时,TCR与CD3信号复合体相关联而激活T细胞。由于TCR基因能从T细胞群体分离出来并转移到其他群体中[93],因此发展了一个治疗策略,从对特异TAA具有高度特异性和活性度的T细胞中取出TCR基因,传递这些cDNAs到采自病人的外周血T细胞中(图1B)。在这个表征里,TCR的转染期待能获得高度的肿瘤反应活性和特异性。开发重组病毒载体,帮助稳定和高效的基因传递,使这种治疗策略成为有可开展的治疗。

双顺反子LVs的发展是一个创新。这实现了更容易表达TCR复合物的α和β基因。反过来,已经使LVs成为表达TCR基因治疗的载体选择[94]。多项用LV 把TCR转染给自体的T细胞治疗针对不同肿瘤的临床试验正在进行中,有靶向NY-ESO-1治疗食管癌临床II期试验[95]。还有各种试验靶向转移黑色素瘤的MART-1,如多个临床实验靶向MART-1,结合自体TCR靶向MART-1与和负载MART-1的DCs的I期联合临床试验[96]。

TCR治疗面临的一个潜在问题是,外源性TCR链和内源性TCR链结合产生的脱靶毒性,导致不希望的异源性TCR形成[97]。解除这个潜在问题的方法,就是利用设计好的核酸酶来清除内源性基因。ZFNs靶向TCR基因能够有效地阻断TCR在细胞中的表达[30]。相比未编辑的T细胞,ZFN-编辑的T细胞,LV转染的Wilms 肿瘤蛋白1特异性的TCR已经具有明显的纯度和低脱靶毒性[30]。这显示了TCR治疗的安全性和有效性具有更多的发展应用前景。

 

嵌合抗原受体(CARs)

最近CAR-T在治疗CD19+的B细胞恶性肿瘤取得的成功,让CARs变得很流行[89,99]。在美国,有20多项用CD19CAR-T细胞治疗各种B细胞恶性肿瘤的临床试验正在进行中或已完成。也许多CARs针对其他实体和血液癌症的TAAs。这些临床前和临床研究正在使用了几个基因转递系统,包括γ逆转录病毒和LVs。

     典型的CARs用法是通过用CAR序列体外转染病人的T细胞作为自体T细胞治疗。顾名思义,CARs由几个不同的域组成,它们衍生自特定的蛋白并被组装成一个人工受体。这些受体被设计成保留在细胞膜上,它们包含细胞外域和细胞内域。细胞外区域可与特定的在肿瘤细胞表面表达的TAA相结合。该区域通常由来自抗体的单链可变片段(scFv)组成,它能识别并结合特定的TAA,将免疫细胞特异性靶向目标癌细胞(图 1A)。细胞内结构域的数量是在1到3个,用于激活或增强T细胞的细胞能力。细胞内结构域也具有细胞因子的分泌、增殖和维持效应细胞功能的作用[100,101]。这些结构域典型的包括来自TCR的CD3ζ[102],以及CD28, OX40 和/或 4-1BB。一般来说,为了直接产生获得性免疫反应,CARs 已经被转染进入CTLs。然而,利用其他细胞,如NK细胞,也正被研究并显示出潜在的优势[103]。

 CAR-T细胞,像其他治疗一样仍然有其自己的局限性。因为CARs一般都有来自鼠源抗体轻链和重链的胞外域,它们可能具有潜在的免疫原性。这有可能使他们被机体清除出去,去除其治疗的效能。此外,即使它们是用人源化抗体修饰,它们仍然是可能产生免疫反应的新型融合多肽。进一步说,CARs只能识别细胞外表达的TAAs,相反,TCRs作用MHC处理后的蛋白,这些蛋白可以是胞内的。虽然这在一定程度上限制了CAR治疗的潜在靶点,MHC的独立性是一个重要的优点,因为癌症通常能够通过沉默MHC表达来逃避免疫监视。进而在这些方面,TCRs与内源性TCRs以二聚体和异源的二聚体形式工作,会导致非期望的脱靶效应。如上面所提到的,在与TCR疗法结合治疗中,ZFNs已经显示出了减少非期望的脱靶毒性的潜在价值。

    CAR 疗法也与一些风险有关。增强的免疫反应成为一个疗法后的结果。这一结果会导致细胞因子风暴:一种不可控的系统性各种细胞因子升高。细胞因子风暴,也称为细胞因子释放综合症(CRS),按严重程度上表现不同,可从发烧,到器官衰竭甚至死亡,因此使之成为一个非常紧急地事件需要说明。也就是说,这样的反应更像机体条件性移植反应规则重新回到病人身上,而不是CAR修饰的T细胞本身[104]。一种用于防止发生CRS的方法就是上面讨论的激活控制细胞命运或自杀系统。通过一个iCasp9系统诱导细胞凋亡方案已经在临床上成功地终止同种异体干细胞移植反应和迅速逆转移植物抗宿主疾病(GVHD)[105]。就如我们实验室开发的dCK和TMPK系统,这个系统和HSV-TK系统可以应用到CAR和TCR T细胞的治疗中。 将效应序列与治疗基因转染到细胞,可在应用前体药时终止细胞治疗,防止对CRS正反馈系统的发展和其他潜在不良反应。

另一个关注点,是转基因修饰的T细胞的脱靶性结合引起的中靶效应。这个问题高度依赖TAA和scFv。通常选用TAAs是由于它们在癌细胞中过表达。然而,因为TAAs是自体抗原,所以在正常组织中也会有低水平的表达。发生的原因是这些抗原的存在提供了生存优势或是由于起源于共同的多功能前体细胞。例如CD19高水平表达在B细胞恶性肿瘤,但在健康的B细胞中也有表达。结果,B细胞缺乏成了CAR治疗的副作用。在这种情况下,相对B细胞短期缺失的后果,接受治疗的病人延长生存期更有价值。因此,选择适当的TAA对CAR治疗成功是至关重要的。

随着对CAR疗法的疗效和减少其脱靶效应的需要增加,进一步的研究需要鉴定新的TAAs和精细调整CAR治疗适当的亲和力和持续时间。还需要应用这种治疗到实体瘤,扩大这一治疗到其他肿瘤类型。尽管这里的一个问题是找到靶向肿瘤细胞。目前的一些研究已经在探索通过 信使核糖核酸(mRNA)电穿孔转染CARs的可能性,而不是用病毒载体来传递[106]。这将引起大大降低CAR表达的周期,防止长期的CRS反应和/或限制了脱靶肿瘤效应。然而,为了诱导这一反应,也需要多重方式的CAR细胞回输。不幸的是,已经发现多重方式回输伴随着副作用例如过敏反应增加的风险[117]。用病毒载体LV实现的长期表达的好处是一次回输CAR修饰细胞就可以获得明显的治疗效果和对癌症复发和进展的长期保护作用。

 

 

结论和展望

在过去的几年里,重组LVs在基因治疗和癌症免疫治疗应用中的增加。有效且稳定的传递能力以及感染非分裂细胞特性,使LVs 有别于其他整合的病毒系统。虽然安全性(主要是插入部分的基因突变)仍然是大家关心的内容。LVs 已经用于广泛的肿瘤治疗,包括但不仅限于,DC和癌细胞疫苗,TCR和CAR基因修饰T细胞治疗。现在为止,一些免疫治疗已经在临床上取得了成功,更多的成果将接踵而至。

 

 

财务与竞争利益的披露

奥尔德姆(RAA Oldham)受到加大拿大卫生研究院,加拿大研究生硕士奖(CIHR CGS Master奖)和MBP卓越UTF奖学金的支持。贝琳斯丁(EMBerinstein)受到了安大略省学生创业信托基金奖(Ontario Student OpportunityTrust Fund Award)和UTF MBP卓越奖学金。除了这些披露,作者没有其他附属或财务上与任何机构或财政利益团体在本课题或本文所讨论的内容方面有任何关系。

 

编译者钱武东,李忠。译自《免疫治疗》2015, 7(3):271-284

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在肿瘤免疫治疗中的慢病毒载体

Robyn AA Oldhan, Elliot M Berinstein, Jeffrey A Medin

 

概要

慢病毒载体提供有效的和可能的基因传递的安全系统

慢病毒载体(LVs)来自复杂的逆转录病毒,具有传染非分裂细胞的能力。

基因整合特性允许长期、稳定转基因表达。

与γ逆转录病毒相比,LVs具有较低的插入突变倾向。

为了增大LVs的安全性,补偿性改变已进行  

第三代基因封装系统和自失活载体可达到止防止慢病毒复制形成的目的。

利用异体的不强增强子功能的启动因子可降低了插入突变频次。

细胞命运控制安全系统允许靶向清除LV转染细胞  

例如常规的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的自杀系统,用于接受治疗的病人,能选择性清除转染细胞。

新系统,如dCK 和  TMPK,寻求避免与HSV-TK相关问题,如免疫源性和无效药物前体转换引起的不完全杀灭。  

肿瘤疫苗

用LV转染改进了DC疫苗:通过提供更稳定更天然的抗原提呈表达机制、帮助制备有效的、可替代的DC前体细胞、延长DC在体外寿命。

LV与共刺激结构域和/或细胞因子转染肿瘤细胞有助于诱导肿瘤特异性免疫反应并保存持续性免疫。

过继T细胞治疗

具有高度亲和力和活性的T细胞受体并能趋向特异性肿瘤已经被亚克隆到病人的T细胞中,使其产生特异性的抗肿瘤T细胞反应。 

双顺子的LVs开发帮助提供了稳定和有效的T细胞受体双链基因的传递。

嵌入抗原受体通过LV转染使免疫细胞具备了选择识别和杀灭癌症细胞的能力。

结论

在癌症免疫治疗中应用LVs是一个不断扩大的领域。

LVs可直接用于转染肿瘤细胞产生抗肿瘤作用或使免疫细胞强大而产生特异的、增强的抗肿瘤反应。

 

 
 

基础科学在癌症免疫治疗的进展已经使各种治疗方法在临床上取得了成功。很多疗法需要将基因插入细胞中,直接杀死目标细胞或重新引起宿主细胞产生强烈地免疫反应。其他类似的治疗方法是通过修饰效应细胞来改善靶向性和增强对肿瘤细胞的杀伤力。最初使用γ逆转录病毒的研究显示了很好的前景,但是对插入突变的潜在安全考虑强化了人们开发基因传递技术的欲望。慢病毒载体(Lentiviral vectors, LVs)被认为是潜在的更有效和更安全的转递载体。LVs已经被用于许多不同类型的遗传和后天疾病包括癌症的临床试验。本文将讨论目前我们对LVs的认识,以及基于病毒载体传递在癌症免疫疗法中的应用。

 
 

关键词:癌症,细胞命运控制系统,细胞免疫,嵌合抗原受体,细胞因子,树突细胞,免疫治疗,慢病毒,T细胞,转基因

 
 

癌症免疫疗法是指为了清除肿瘤细胞而利用免疫系统的治疗方法。体内的免疫细胞本来已拥有识别和攻击恶性肿瘤的机制; 然而,肿瘤细胞经常采取对抗这些机制的措施,致使其失效。免疫疗法通过各种不同的方法寻求增强和补偿这些正常反应,包括抗体和细胞因子疗法,癌症疫苗和过继细胞输入。无论是直接杀灭、诱发免疫反应或者提高免疫细胞的靶向性和细胞毒性,这些治疗方法都要求对病患细胞进行基因修饰。为了使这些基因疗法在临床中切实可行,必须要有一套能安全和有效地传递基因的可靠方法。迄今为止,许多不同的方法已经在研究和测试。

 

用重组γ逆转录病毒(akaoncoretrovirus,也称致癌逆转录病毒)把一个特定的T细胞受体转入淋巴细胞用于治疗黑素瘤,是第一个探索从改造免疫细胞基因实现癌症免疫治疗的临床试验。这项工作自2006年公开发表以后,利用各种基因传递方法探索了许多不同的癌症免疫治疗方法。一些病毒和非病毒式的系统现在已经应用。重组γ(Gamma)逆转录病毒仍然是一个常见的选择;然而,慢病毒载体(LVs)成为另一种潜在的、更有效和更安全的选择已经出现。到2014年1月,γ(Gamma)逆转录病毒被用于19.2%的基因治疗试验[2]。但目前,在所有公开和以往试验中,LVs只占3.5%,然而,这个数字正在增加[2]。

 

其他常用的病毒基因传递方式包括重组腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)。腺病毒载体表达滴度较高,但是可引起不良的免疫反应,并且不整合到宿主基因组中限制了基因表达的持久性[3]。已知野生型AAV更倾向整合至基因组的一个位点,但是重组AAV的整合并不在可预知的效率[4]。此外,AAV载体容量较小,限制了其传递基因的大小[5]。γ逆转录病毒和LVs都能够有效地将它们的DNA插入宿主基因组中,从而使转基因产品得以稳定和长期的表达。这有助于确保最大的治疗效果,这也是为什么这些载体经常被选择用于针对癌症免疫疗法的原因之一。

 

慢病毒生物学与生命周期

LVs属于逆转录病毒科,但它们比γ逆转录病毒拥有更复杂的基因组。所有逆转录病毒都包含病毒感染和复制所需的基本基因组。这些包括编码结构蛋白的gag基因、编码酶蛋白的pol基因,和编码包壳糖蛋白的env基因。LVs也具有病毒复制需要基因rev和tat,和辅助基因vif,vpr,vpu和nef。这些辅助基因的功可见Malim和Emerman发表的综述[6[。结构蛋白对于环绕病毒颗粒核心RNA的包装性结构序列是必不可少的。病毒核心包含两套完全相同的RNA与酶蛋白整合酶,逆转录酶和蛋白酶,与核衣壳蛋白形成复合体[7]。从外面到核心是与脂质膜的外层相互作用的基质蛋白质层。env基因编码的糖蛋白镶嵌在外层。

病毒感染启始于env编码的糖蛋白与细胞膜上的受体结合。在LV介导的基因治疗应用,最常用的包壳蛋白是来自疱疹性口炎病毒的糖蛋白,它通过与低密度脂蛋白(LDL)受体和类似的家族成员结合使病毒具有一种广泛的亲向性[8]。这个结合可让病毒与细胞融合,然后病毒的内容被传送到细胞内部。一旦进入,病毒就会脱壳,病毒核心成分释放到细胞质中。这包括单链RNA基因组,再转化为cDNA,转移到细胞核。在γ逆转录病毒感染过程中,细胞必须在病毒DNA进入细胞核之前进行分裂(也就是核膜的溶解)。另一方面,LVs,还有其他的特性,包括中心DNA活瓣和其他不确定因素,允许病毒DNA通过完整的核膜传递[9]。γ逆转录病毒和LVs两者都将它们(现在的双链)DNA整合到宿主基因组中,然后利用宿主基因组机制将它们的基因转录到RNA上。一旦来自野生型逆转录病毒的RNA复制并回到细胞质中,就被翻译并包装进一个新的病毒粒子,它将会从细胞芽胞释放,完成生命周期[10]。

 

 

 

慢病毒介导的基因传递安全性的发展历程

慢病毒转递系统

在基因疗法中,为了使安全性最大化,人们对LV基因组进行了许多改造。这些改变被分为三次迭代。在当前的第三代系统中,病毒基因组成份被分散进入一种包装质粒、一个转递质粒和一个包壳质粒,再转染进HEK 293T细胞进行病毒生产。包装质粒含有在病毒生产中转染所需要的所有元素。这包括结构基因,酶蛋白质gag,pol,以及病毒调控基因rev。另一种情况,rev可被第二个包装质粒来表达形成四质粒系统。传递质粒含感兴趣的基因和必要的顺式调控元件,比如Ψ (psi)RNA包装信号,3'和修饰的5’LTR元件[11]。这个修改过的5'LTR用有活性的tat独立启动子替换了内源性HIV启动子,允许tat基因不在包装质粒上[12]。env编码蛋白在一个分开的质粒中被表达出来,这样可以改变病毒的亲和性,也称为假性配型。这种多质粒系统保证了在随后的转染中只保存感兴趣的转基因和顺式作用序列。一些不必要的病毒蛋白,如辅助蛋白,被一起被忽略,这样有助于降低免疫原性[13],而删除这些编码序列进一步降低重组导致可复制潜能的慢病毒产生的可能性。

在第二代和第三代系统中,有了进一步安全方面的改进,包括自身失活的转染载体的开发。这是通过把转染载体的3′LTR的U3部位删除实现的,在逆转录和整合之后被转移到5'LTR,使LTR启动子活性有效地减少[14,15]。此外,这个删除没有根本性影响病毒的滴度,又减少了启动子的干扰,因为启动子干扰可能导致不良的转基因沉默。病毒基因分裂成不同的质粒,以及自灭活转染载体的使用,进一步降低了有复制能力的慢病毒产生的可能性。

其他优化载体的方法也进行了研究,包括中央多嘌呤片段的插入,可其改善预整合复合体的核内转运 [16],及土拨鼠乙肝病毒转录后调控元素,后者在促进转基因方面发挥作用[17]。这些特性协同工作以提高转染效率和转基因表达[18]。细胞特异性或诱导型启动子也是很有用的工具。细胞特异的启动子或组织特异的启动子,可靶向转基因在特异组织表达,例如肿瘤细胞,目的是减少脱靶效应。另外,诱导型启动子,通过服用抗生素如四环素,可以在需要的时候打开或关闭基因表达[19]。在癌症免疫疗法的背景下,免疫细胞可根据需要携带整合原病毒来提供抗癌治疗,但是降低持续转基因表达有助于减少不良副作用。

插入突变的风险

不论对基因传递系统怎样改造和优化,对LV安全性的担忧仍然存在。担忧主要在于插入基因发生突变的潜在风险。第一种明确的成功的利用γ逆转录酶病毒的基因治疗,是针对儿童重症联合免疫缺陷疾病(SCID-X1)[20]。不幸的是,基因治疗后,许多病人发生了白血病。逆转录病毒生命周期的基因组整合步骤是一种非定向插入,因此,有机会整合进一个调节生长的位点。可能发生前病毒插入的一些“热点”已经证实。为了评估插入突变的相关风险,Cattoglio等人在2007年进行的一项研究中,绘制了LV和γ逆转录病毒感染CD34+造血细胞的“热点”图。γ逆转录病毒在“热点”中插入的机率大约21%,并常见在原癌基因和生长控制基因[21]。而LVs插入热点的机率较小,大约有8% ,并且不在原癌基因和生长控制基因[21]。在LV转染进骨髓细胞[22]和肝细胞[23]的体内研究中,发现前病毒插入主要发生在有活性的基因中,插入部位不在与生长有关的基因。此外,LV感染后没有观察到克隆性扩张[22,23],提示载体诱导肿瘤发生的风险很低。到目前为止,这项工作支持重组的LVs相对于修饰后的γ逆转录病毒更安全的推论。

设计的核酸酶

另外一种已经在研究的处理插入引起突变潜在问题的方法是开发非整合的慢病毒载体(NILVs) [24]。具体地说,整合酶基因蛋白的点变化阻止了基因组整合;换句话说,含有转基因的质粒仍然游离地保留在细胞核中[25]。这种策略产生的转基因表达比整合载体更低,而且是瞬时表达转基因[26]。这项技术进一步允许NILV DNA通过使用锌指核酸酶(ZFNs)在一个特定的目标靶点上进行同源重组,而产生双链断裂来启动同源修复通路[27]。

这个方法允许对基因序列进行靶向校正,以降低插入突变的风险。转录激活样效应核酸酶(TALENs)在功能上类似于锌指酶(ZFNs),但是其DNA识别域的设计更简单,也更灵活。最近发表的一项研究,报告了靶向人类蛋白质编码基因的18740个TALENs构建情况[28]。临床前研究表明,NILVs已经被证明在癌症免疫疗法里是有用的。它们已经被单独应用,比如利用NILVs做癌症疫苗[29],以及与设计者核酸酶结合,就像在T细胞里结合锌指酶(ZFNs)表达肿瘤特异性T细胞受体(TCRs),从而干扰内源性TCR基因以增加其效力和安全性[30]。

基因组编辑系统 CRISPR/Cas 是最近开发的另一种实施特定位点双链断裂方法;该系统利用RNA分子标识切割位点并由Cas核酸酶切割[31]。在小鼠胚胎干细胞使用LVs和CRISPR系统实现定点诱变的功能缺失筛选,其方法比RNAi 更有效地抑制基因表达[32]。LVs和人类细胞的研究也已完成,在2013年吉尔伯特等将失活的Cas9与调控蛋白融合,依靠RNA引导实现基因的定向抑制或激活。在转染14天后,CRISPR/Cas转基因仍能继续稳定表达[33]。   

虽然上述的技术前景广阔且肯定在进一步发展,有一些问题需要克服。由于同一或同源的DNA序列而导致的脱靶突变是ZFN和TALEN系统的一种风险,crispr/cas系统甚或风险更大[34]。为了解决这个问题,仔细地选择靶位点和控制CRISPR/Cas剂量有益于减少风险[35,36]。其他选项,例如转换Cas9到切割酶的方法也正在研究[37]。ZFN切割酶的开发已经被报道[38–40]。这个系统的效率也在优化中。就CRISPR/Cas来说,下游间区序列邻近基序(PAM)需要限制了靶向的位点,因此开发一个间区序列邻近基序的独立系统是有益的。这些系统在原代细胞中的效率是另外一个妨碍其广泛使用的问题。最后,这些系统的转递模式还在开发中。因为大的转基因是病毒转染系统的一个限制因素,因为传递系统有大小限制。LVs可能对ZFN and CRISPR/Cas系统是个可行的选项,但对TALENs已经被证实是不相容,原因在于在转基因传递之后高度重复的TALEN序列的趋向于重新排列[41]。因此,进一步开发转基因交付技术将至关重要。

细胞命运控制安全元件(自杀机制)

细胞或基因治疗产品应用后可能会发生的副作用,细胞命运控制(也称为自杀机制)元件提供了一个缓解办法。这个方法涉及加入转基因序列,允许选择性地清除已用于病人身上的转基因细胞。这些系统通常是基于一种酶的特殊的突变形式,与细胞治疗序列一起转入靶细胞。这些被改变的酶使细胞具有能将一种无毒药前体转化为一种细胞毒性化合物,最终清除靶细胞。

传统的单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) cDNA是一个广泛使用的自杀系统,包括转换更昔洛韦(GCV)前体药成细胞毒性的更昔洛韦-三磷酸盐(GCV-TP)[42]。这个系统已经在临床试验取得成功。然而,靶细胞的消除并不总是完全有效。这可能是由于GVC-TP细胞毒性依赖于细胞周期的,因此是非分裂细胞是不受影响的。这可能是因为底物动力学活力不够和或有限转换过程的重新定位,到下一个途径中的酶(鸟苷酸激酶)是有问题的。这个不完全根除导致病人面对剩余的负作用。此外,GCV经常用于干细胞移植患者,作为一种预防药治疗机会性巨细胞病毒感染,由此,从清除疗法中排除了部分患者涉及安全系统的问题[43]。这个系统的免疫原性是第三个关心的问题。HSV-TK基因产品是病毒起原的,因此,它会在转染细胞中的存在通过宿主免疫系统在产生积极的效果之前引起它们的清除[44]。

为了应对与HSV-TK相关的缺陷,我们实验室开发了两套新的细胞命运控制系统。它们被称为TMPK[45]和dCK[46]。两个系统都是基于对人类酶的最小修饰,因此预计只会在病人中产生较低的免疫原性。此外,它们能以良好的安全性能与相关的动力学激活前体药。改变后的TMPK有能力激活前体药叠氮胸苷,成为有毒的叠氮胸苷三磷酸盐,从而导致细胞凋亡。这是在TMPK突变表达的细胞中通过降低线粒体内膜电位和caspase-3的激活来实现的[45].此外,我们近来也证明了突变的TMPK可以被有效地与细胞表面标志融合在一起,因此,载体滴度和跟踪功能与之相结合来达到根除的目的[47]。我们实验室开发的第二个系统是基于人类的脱氧胞苷激酶(dCK)。这种酶在核苷酸合成的补救途径中是必不可少的激酶。dCK的突变体被设计成含有多个活性的位点,这些位点允许酶去激活多种与临床相关的前体药,但是我们的工作主要集中在两个方面:BVdU和LdT[46]。这个系统是非常有选择性的,因为是野生型的dCK对这些化合物的转换不理想。此外,由于有多种前体药可用选择,也可以在根据不同病人上选择适当的效应化合物。

LVs在癌症免疫疗法的应用

免疫系统的操控,尤其是细胞免疫,正在成为抗癌一个重要的策略。考虑到这个研究/治疗领域里多样性的历史,不管是感知还是现实,真正的重生目前都正在发生。成功的治疗方法通常是两方面的:给免疫系统提供肿瘤相关靶点来识别;改造法去激活或者重定向宿主的免疫反应。在这里,我们将综述一下LVs是如何被用于癌细胞和免疫细胞的基因修饰,以起动和促进癌症免疫治疗。

 

 

癌症疫苗

树突状细胞疫苗

多种的策略已经应用于抗癌疫苗开发。他们的主要目标是刺激Th1的反应,包括细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),有选择性地靶向和消灭癌症。一类注定有利于促进抗癌疫苗治疗的细胞是树突状细胞(DCs)。DCs是专职的抗原提呈细胞,通过MHC-I、II获取、加工并向T细胞抗原。在这一过程中,DCs可以诱导特异性的Th1反应,包含CTLs。树突状细胞(DCs)受到炎症信号的刺激时,迅速成熟,加工和提呈抗原,并迁移到次级淋巴器官去引发免疫反应[48]。制备疫苗在某些方面可采集患者的树突细胞,接着在体外加载肿瘤相关抗原(TAA)。改造后细胞然后被回输给病人。这些负载的DCs有能力将处理过的TAAs提呈给T细胞,诱导Th1对表达TAA的细胞反应[49](见附图1D)。事实上,到目前为止,唯一经美国食品药品管理局批准的细胞调控免疫疗法是DC癌症疫苗,Sipuleucel-T。Sipuleucel-T治疗是向患者的DCs加载前列腺酸性磷酸酶(一种前列腺癌TAA)多肽和GM-CSF [50]来进行的。GM-CSF 是一种刺激巨噬细胞增殖和树突状细胞渗透的炎症细胞因子。这种组合成功地诱发了免疫反应,已经被证明可以延长患者的生命期平均为4个月。

 然而,以加载多肽为特征的DC疫苗疗法也面临几个障碍。体外将肿瘤抗原加在MHC是很短暂,阻止了长期的免疫效果。此外,这个反应是MHC单倍型的依赖,因此需要针对每一个病人进行个性化定制。此外,选择加载MHC复合体的特异肽序列是困难的,需要这个领域的研究继续优化这个选择过程。一个克服这些障碍的办法是用病毒载体携带完整的TAA cDNA去转染DCs[51]。已经证明了肿瘤抗原稳定表达,保证DC在免疫系统中以更自然的方式和在一个较长时间能处理和提呈抗原。

 

                  

图1. 慢病毒载体在肿瘤免疫治疗中的应用。CAR:Chimeric     antigen receptor; LV: Lentiviral vector; TAA: Tumor-associated antigen;     TCR: T-cell receptor

 

如上所述,DCs通过MHCs向T细胞的TCR显示处理过的抗原肽。然而,这个信号可能还不足以诱发T细胞反应。相反,已经表明这种相互作用可以独自导致T细胞失能和死亡[52]。在这种相互作用的基础上,更多的共剌激信号作为激活特性的免疫突触是诱导适当的细胞毒性T细胞反应所需要的[53]。细胞因子作为第三个信号帮助刺激和趋化细胞反应[54]。LVs用于加载DCs、激活它们的共同刺激信号,和/或者为了趋化T细胞释放特定的细胞因子。已经证明了,利用LVs可抑制DCs表面抑制性共刺激结构域PD-L1,可以加速抗肿瘤免疫反应[55]。此外,已经显示,用sPD-1或sPD-L1修饰DCs,以释放来干扰在免疫突触相互作用引起的CD80表达上调,一个共同刺激结构域激活和一个分别增高的肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素10(IL-10)细胞因子谱[56]。PD-1抑制剂已经显示可阻断T细胞抑制共刺激结构域,加速激活的DC中的抗肿瘤免疫反应[57]。另一种策略是使用LVs调节细胞内的通路。LVs修饰DCs 表达在p38 MAPK通路上的活跃蛋白,成功地增强抗肿瘤T细胞反应,延长荷瘤老鼠的存活时间[58]。在这项研究中,作者展示了激活p38导致上调共刺激结构域CD80、CD40和ICAM-I,帮助DCs诱发抗肿瘤T细胞反应[58]。许多增强DC疫苗的抗肿瘤潜力的策略正在探索中。

病毒载体也可以添加来自病毒蛋白的共刺激信号。这些共刺激信号可以帮助诱发免疫反应。例如,我们的实验室显示了Ad转染的DCs与LV转染的DCs相比有不同的免疫反应,当两者都表达HER/2抗原时[59]。Ad转染的DCs刺激CD4+和CD8+的T细胞反应,及强烈的体液反应。相反,LV转染DCs主要诱发的CD4+T细胞的反应,伴随着较高的IFN-γ分泌物浓度和较低的体液反应。这表明选择了病毒载体在DC疫苗引起的免疫反应中起着重要作用。因此,重要的是不仅要选择可靠的TAA,还要考虑最好的适合各个应用的传递载体。

正是LVs那些独特的品质,使它们可能成为有吸引力的病毒载体系统,把DCs转染成疫苗。如前所述,它们是有能力的在两种分裂和非分裂细胞中提供稳定的基因转移,具有较低的基因毒性系数。已经证明,LV转染独立于包膜伪型但依赖于细胞输入,LV转染激活DCs,释放1型干扰素(IFN),LV转染调制免疫原性去携带抗原[60]。进一步显示,这是通过TLR依赖机制发生的[61]。用LV进行各种TAAs转染的DCs已经在小鼠身上进行了临床试验,以测试它们激发免疫反应的能力。这些能激发免疫发应的TAAs包括黑色素瘤抗原mTRP-2 [62,63] 和MART-1 [64]。也研究了肝细胞瘤抗原,包括Sca-2,GP38 和细胞的 RABP1 [65]。TAAserbB2 [66]和 PSCA [67]已经用于针对前列腺癌。所有这些LV转染的TAAs都能帮助引导DCs诱导特定的免疫反应,从而实现有效的肿瘤抑制。

LVs具有独特性质,使之成为用于转染DCs成为疫苗的有吸引力的病毒载体系统。就像以前提到的,它能够为分裂和未分裂细胞提供稳定基因传递,并且免疫毒性低。已经证明是不依赖包壳蛋白和假型但依赖细胞的进入,LV转染激活DCs,释放I型IFN和调节对携带抗原的免疫原性[60]。进一步发现这个作用是通过TLR依赖机制[61]。为了检测其激活免疫功能,利用转染多种TAA的DCs已用于前期临床的小鼠实验。一些TAAs能够引起免疫反应,包括黑色素瘤抗原mTRP-2[62,63]和MART-1[64]. 肝肿瘤TAAs也有研究,包括Sca-2, GP38和细胞RABP[65]. TAAs erB2[66]和PSCA[67]已经用于靶向前列腺癌。所有这些LV转染的TAAs能够帮助DCs诱导特异免疫反应,引起肿瘤明显抑制。

不论这种类型治疗的潜在疗效如何,DC疫苗仍有许多问题需要克服。基于DC的疫苗通常是自体的:在治疗之前,需要从每个患者身上采集DCs。然而,DCs在外周血中数量有限。有一种方法能够克服这个问题,就是通过分离CD14+单核细胞前体和CD34+血液或骨髓DC前体,加入细胞因子和生长因子的结合物使它们分化为成熟的树突细胞 [68-70]。自从这个方法使用以来,许多研究机构已经成功地用LV转染CD14+-CD34+-衍生的DCs,以产生高水平的转基因表达[71,72]。另一个正在探索的策略是利用来自人多功能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞[73,74诱导产生的DCs。人iPSCs已经从供体真皮纤维母细胞中通过LV转染了OCT3/4,SOX2,c-MYC 和 Klf4转基因重编程获到[73]。这些具有多种潜能和自我更新能力的iPSCs可以分化成有功能的DC,具备所需的表达谱、细胞形态和细胞因子,使它们有能力诱导抗原特异性T细胞反应[73]。DCs的这些功能将有助于大规模生产,使临床使用成为可能,并有可能帮助绕过目前存在的病人-病人的变异性和恢复的问题。

这种治疗方式面临的其他挑战包括体外用于制备疫苗的时间框架是有限。动力学研究表明,携带抗原的DC寿命是短暂的[75],这使得达到有效加工、抗原加载和成熟变得非常困难。通过使用LVs将c-FLIPS,c-FLIPL, Bcl-XL 和 M11L基因的cDNA 转染 DCs,我们已经成功地延长了DC的生存时间[76]。这些基因编码为生存因子,在内在和外在的细胞凋亡途径发挥作用。LVs的益处有助于促进DC疫苗提供并产生更强大的免疫反应,从而进一步延长患者生存期。

体外疫苗接种研究的成功激发了对LVs携带TAAcDNA序列直接免疫的评估。小鼠皮下注射LVs可引起由皮肤衍生的DCs来直接诱发[77]。然后,这些DCs游向淋巴结,诱导T细胞的反应,并产生长期的抗肿瘤免疫。研究还显示,在小鼠肌肉内和腹腔内注射LVs也能产生有效的免疫反应[78,79]。这种策略比上文所述的体外转染概念上存在更多的突变风险,但可能能够绕开DC苗的一些后续限制,包括需要每例每人都要进行分离和扩增细胞。更多的研究需要对直接注射LVs作为一种肿瘤免疫接种方法来评价其治疗潜力和安全性。

 

肿瘤细胞疫苗

专业性抗原提呈细胞(APCs),如DCs和B细胞,会被用于提呈免疫系统识别的TAA。它们也能为T细胞提供各种各样的共刺激作用,如诱导特异抗癌T细胞应答。然而,成熟树突细胞的生成可能是困难的,需要资源强化,及大量的细胞因子。一项上面提到的技术变化是用共刺激因子和/或细胞因子把癌症细胞转染成为自体疫苗。这项技术利用了在癌细胞中可能已经有表达各种各样的TAAs。通过在癌症细胞中加入共刺激结构域,激活针对一些癌细胞抗原的辅助性T淋巴细胞(Th1)反应(见图1C)。这样可激活细胞毒性淋巴细胞(CTL)有选择性地靶向和清除肿瘤细胞。某些形式的白血病是发展疫苗的好选项,因为它们表达MHC1和MHC2(主要组织相溶性复合体1、2)分子以及TAAs,但缺少共刺激蛋白[80]。这意味着白血病细胞有潜在信号让免疫细胞区分白血病细胞和健康细胞,但缺少激活免疫系统的共刺激结构域。因此,通过增入免疫系统的共刺激结构域和/或细胞因子成份,使白血病细胞可以转变成全细胞疫苗,预警和刺激免疫系统。结果引起T细胞胞增殖和攻击具有表达肿瘤样的TAA文谱的细胞。理想地话,它应该为病人提供对白血病的长期免疫。

白介素12(IL-12) 是一种 Th1趋化的细胞因子,当静脉注射IL-2在小鼠和人时,将产生所谓的抗白血病效果。这包括但不限于,T细胞介导的特异抗原的清除。在各种临床前的小鼠模型研究中,全身回输这种细胞因子取得了非常好的成功,说明对第二次注射的基因相似的肿瘤细胞可完全的清除甚至产生免疫 [81]。这一临床前成功实验已经带动了一期和二期临床试验。不幸的是,IL-12系统注射的二期临床试验已经显示在病人体内产生了严重的细胞毒性,而反应率低[82]。这个毒性是由于次级细胞因子的产生,γ干扰素(IFN-γ)和α肿瘤坏死因子(TNF-α),趋化因子,干扰诱导因子10(IP-10)和结膜免疫球蛋白(MIG) [83,84]。在此基础上,研究表明白介素12(IL-12)的反应被抑制细胞因子白介素10(IL-10)所中和,并阻断系统性的辅助性T细胞(Th1)的趋化[85]。

传递IL-12的第二种方法是通过肿瘤细胞,即有效地将肿瘤细胞转化为肿瘤细胞疫苗。已经表明转染B7–1 和 IL-12的B细胞淋巴瘤,然后被注射到小鼠,可引起细胞因子趋化变化,使辅助性T淋巴细胞1(Th1)反应和诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性[86]。来自白血病的含有表达IL-12的白血病LV的癌症细胞疫苗,在小鼠模型中被用于对抗系统IL-2[87]。老鼠不仅能够排斥产生IL-12的白血病细胞,也能清除非转染的白血病细胞。所有注射修饰后表达IL-12细胞的小鼠都能存活一定时期,并有对白血病的长期保护作用。进一步来说,为了获得这样的生存期和长期免疫的目的,需要注射至少0.2%的白血病细胞种群和能高水平地产出IL-12。最后,这种细胞介导的治疗证实没有看到IL-10的提高。很可能是, 局部控制IL-12释放到微环境可消除了机体对其阻断作用的需要。

这种细胞介导的治疗方法应该也降低这种细胞因子治疗引起脱靶毒性,因为它是用T细胞介导的对特异肿瘤的反应,取代了简单地诱导所有T细胞的趋化反应。前面提到的治疗组已经证明了这种模式在实体瘤中有效性[88]。他们表明自体疫苗方法能够使小鼠获得排斥实体瘤并维持长期免疫的能力。在这项研究中,在以IL-12为基础的治疗中,肿瘤浸润淋巴细胞的数量也增加了。

许多其他LV全细胞抗瘤疫苗已经开发并在临床试验中。例如,在急性粒细胞白血病(AML)细胞中转入CD80和GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-群刺激因子),GM-CSF是一种能刺激巨噬细胞生产和DC浸润的炎症性细胞因子。这样使DCs表达抗原,反过来,促进T细胞扩增和抗肿瘤反应[89]。另一个全细胞疫苗,是用LVs把CD80和IL-2 cDNAs 转染到急性髓细胞白血病(AML)细胞中[90]。 IL-2是一种Th1趋化性细胞因子,与IL-12非常相似,但更倾向CTL而不是一种抗体反应。推测能产生更强的肿瘤免疫反应。像IL-12一样,IL-2被体内转入用于癌症治疗,但它的毒性问题也被发现[91]。

 

人工抗原提呈细胞(aAPCs)

人工抗原提呈细胞(aAPCs)是另一种肿瘤免疫治疗形式,它采用了LV传递基因的实效性。这些aAPCs用于促进T细胞的体外扩增。aAPCs发挥作用一般是在细胞表面或磁性微珠上表达共刺激结构域和TAAs。LVs能用于把白血病细胞转换成aAPCs,方法是将表达共刺激分子或细胞因子的LVs转染到细胞中。当白血病细胞在其表面能提呈各种TAAs时, aAPCs可以设定为特定的分子来允许适当的T细胞激活和增殖。

白血病细胞系K562,通过LV转染CD80和/或4-1BBL载体后,可被转换成aAPCs [92]。在不需要外源的细胞因子的情况下,这些aAPCs有能力支持T细胞的体外生长和长期扩增。CD80表达在激活的抗原提呈细胞(APCs)、B细胞和单核细胞上,并为T细胞提供共刺激信号,促进活性和生存。4-1BBL表达在DCs的表面上 ,代表一个共刺激结构域,功能在于增强T细胞增殖、细胞因子分泌和溶解细胞能力。进一步研究者展示了他们的K562 CD80+4-1BBL+ 的aAPCs能使CD8+ T细胞体外扩增大约10,000倍,包括已经基因改造的T细胞[92]。其他体外扩增方法,如微珠或其他aAPCs,也近十几倍。这种方法有助于克服自体T细胞疗法面临的最大问题之一:有限的靶向效应细胞的体外扩增数量。值得注意的是,这也引发了一种在过继性免疫治疗中很重要的多克隆T细胞扩增,这有利于效应功能和特异性之间的平衡。

 

过继T细胞

由于近期临床上取得的成功,过继回输基因修饰T细胞走到了癌症免疫治疗的前沿。相比其他免疫治疗,T细胞治疗的优势之一是能找到肿瘤的原发部位。T细胞一旦到达肿瘤部位,经TAAs的特异性刺激而增殖、保留并攻击肿瘤细胞。自体T细胞治疗通常包括采集病人的T细胞,然后筛选出活性良好、并且与所选抗原有亲和力的T细胞。接着激活、扩增这些细胞,并再回输给病人。尽管客观临床反应已有报道,这类治疗还面临许多问题,包括缺乏天然存在的抗原特异性T细胞、无力打破肿瘤耐受性,以及扩增这些细胞到足够数量的难度。一些基于转基因的修饰方案已经能够对付这些问题。T细胞经特定修饰后,使他们增强了识别、增殖、并扼杀特定肿瘤细胞的能力。这方面将涉及用于T细胞的基因修饰方法,包括利用重组LVs对T细胞的异源TCRs和嵌入抗原受体进行加工修饰。

 

T细胞受体

T细胞受体(TCRs)是由一个α 链和 一个β链组成的异二聚体结构,能识别主要组织相溶性复合体(MHC)加工的细胞内蛋白。当TCR受刺激时,TCR与CD3信号复合体相关联而激活T细胞。由于TCR基因能从T细胞群体分离出来并转移到其他群体中[93],因此发展了一个治疗策略,从对特异TAA具有高度特异性和活性度的T细胞中取出TCR基因,传递这些cDNAs到采自病人的外周血T细胞中(图1B)。在这个表征里,TCR的转染期待能获得高度的肿瘤反应活性和特异性。开发重组病毒载体,帮助稳定和高效的基因传递,使这种治疗策略成为有可开展的治疗。

双顺反子LVs的发展是一个创新。这实现了更容易表达TCR复合物的α和β基因。反过来,已经使LVs成为表达TCR基因治疗的载体选择[94]。多项用LV 把TCR转染给自体的T细胞治疗针对不同肿瘤的临床试验正在进行中,有靶向NY-ESO-1治疗食管癌临床II期试验[95]。还有各种试验靶向转移黑色素瘤的MART-1,如多个临床实验靶向MART-1,结合自体TCR靶向MART-1与和负载MART-1的DCs的I期联合临床试验[96]。

TCR治疗面临的一个潜在问题是,外源性TCR链和内源性TCR链结合产生的脱靶毒性,导致不希望的异源性TCR形成[97]。解除这个潜在问题的方法,就是利用设计好的核酸酶来清除内源性基因。ZFNs靶向TCR基因能够有效地阻断TCR在细胞中的表达[30]。相比未编辑的T细胞,ZFN-编辑的T细胞,LV转染的Wilms 肿瘤蛋白1特异性的TCR已经具有明显的纯度和低脱靶毒性[30]。这显示了TCR治疗的安全性和有效性具有更多的发展应用前景。

 

嵌合抗原受体(CARs)

最近CAR-T在治疗CD19+的B细胞恶性肿瘤取得的成功,让CARs变得很流行[89,99]。在美国,有20多项用CD19CAR-T细胞治疗各种B细胞恶性肿瘤的临床试验正在进行中或已完成。也许多CARs针对其他实体和血液癌症的TAAs。这些临床前和临床研究正在使用了几个基因转递系统,包括γ逆转录病毒和LVs。

     典型的CARs用法是通过用CAR序列体外转染病人的T细胞作为自体T细胞治疗。顾名思义,CARs由几个不同的域组成,它们衍生自特定的蛋白并被组装成一个人工受体。这些受体被设计成保留在细胞膜上,它们包含细胞外域和细胞内域。细胞外区域可与特定的在肿瘤细胞表面表达的TAA相结合。该区域通常由来自抗体的单链可变片段(scFv)组成,它能识别并结合特定的TAA,将免疫细胞特异性靶向目标癌细胞(图 1A)。细胞内结构域的数量是在1到3个,用于激活或增强T细胞的细胞能力。细胞内结构域也具有细胞因子的分泌、增殖和维持效应细胞功能的作用[100,101]。这些结构域典型的包括来自TCR的CD3ζ[102],以及CD28, OX40 和/或 4-1BB。一般来说,为了直接产生获得性免疫反应,CARs 已经被转染进入CTLs。然而,利用其他细胞,如NK细胞,也正被研究并显示出潜在的优势[103]。

 CAR-T细胞,像其他治疗一样仍然有其自己的局限性。因为CARs一般都有来自鼠源抗体轻链和重链的胞外域,它们可能具有潜在的免疫原性。这有可能使他们被机体清除出去,去除其治疗的效能。此外,即使它们是用人源化抗体修饰,它们仍然是可能产生免疫反应的新型融合多肽。进一步说,CARs只能识别细胞外表达的TAAs,相反,TCRs作用MHC处理后的蛋白,这些蛋白可以是胞内的。虽然这在一定程度上限制了CAR治疗的潜在靶点,MHC的独立性是一个重要的优点,因为癌症通常能够通过沉默MHC表达来逃避免疫监视。进而在这些方面,TCRs与内源性TCRs以二聚体和异源的二聚体形式工作,会导致非期望的脱靶效应。如上面所提到的,在与TCR疗法结合治疗中,ZFNs已经显示出了减少非期望的脱靶毒性的潜在价值。

    CAR 疗法也与一些风险有关。增强的免疫反应成为一个疗法后的结果。这一结果会导致细胞因子风暴:一种不可控的系统性各种细胞因子升高。细胞因子风暴,也称为细胞因子释放综合症(CRS),按严重程度上表现不同,可从发烧,到器官衰竭甚至死亡,因此使之成为一个非常紧急地事件需要说明。也就是说,这样的反应更像机体条件性移植反应规则重新回到病人身上,而不是CAR修饰的T细胞本身[104]。一种用于防止发生CRS的方法就是上面讨论的激活控制细胞命运或自杀系统。通过一个iCasp9系统诱导细胞凋亡方案已经在临床上成功地终止同种异体干细胞移植反应和迅速逆转移植物抗宿主疾病(GVHD)[105]。就如我们实验室开发的dCK和TMPK系统,这个系统和HSV-TK系统可以应用到CAR和TCR T细胞的治疗中。 将效应序列与治疗基因转染到细胞,可在应用前体药时终止细胞治疗,防止对CRS正反馈系统的发展和其他潜在不良反应。

另一个关注点,是转基因修饰的T细胞的脱靶性结合引起的中靶效应。这个问题高度依赖TAA和scFv。通常选用TAAs是由于它们在癌细胞中过表达。然而,因为TAAs是自体抗原,所以在正常组织中也会有低水平的表达。发生的原因是这些抗原的存在提供了生存优势或是由于起源于共同的多功能前体细胞。例如CD19高水平表达在B细胞恶性肿瘤,但在健康的B细胞中也有表达。结果,B细胞缺乏成了CAR治疗的副作用。在这种情况下,相对B细胞短期缺失的后果,接受治疗的病人延长生存期更有价值。因此,选择适当的TAA对CAR治疗成功是至关重要的。

随着对CAR疗法的疗效和减少其脱靶效应的需要增加,进一步的研究需要鉴定新的TAAs和精细调整CAR治疗适当的亲和力和持续时间。还需要应用这种治疗到实体瘤,扩大这一治疗到其他肿瘤类型。尽管这里的一个问题是找到靶向肿瘤细胞。目前的一些研究已经在探索通过 信使核糖核酸(mRNA)电穿孔转染CARs的可能性,而不是用病毒载体来传递[106]。这将引起大大降低CAR表达的周期,防止长期的CRS反应和/或限制了脱靶肿瘤效应。然而,为了诱导这一反应,也需要多重方式的CAR细胞回输。不幸的是,已经发现多重方式回输伴随着副作用例如过敏反应增加的风险[117]。用病毒载体LV实现的长期表达的好处是一次回输CAR修饰细胞就可以获得明显的治疗效果和对癌症复发和进展的长期保护作用。

 

 

结论和展望

在过去的几年里,重组LVs在基因治疗和癌症免疫治疗应用中的增加。有效且稳定的传递能力以及感染非分裂细胞特性,使LVs 有别于其他整合的病毒系统。虽然安全性(主要是插入部分的基因突变)仍然是大家关心的内容。LVs 已经用于广泛的肿瘤治疗,包括但不仅限于,DC和癌细胞疫苗,TCR和CAR基因修饰T细胞治疗。现在为止,一些免疫治疗已经在临床上取得了成功,更多的成果将接踵而至。

 

 

财务与竞争利益的披露

奥尔德姆(RAA Oldham)受到加大拿大卫生研究院,加拿大研究生硕士奖(CIHR CGS Master奖)和MBP卓越UTF奖学金的支持。贝琳斯丁(EMBerinstein)受到了安大略省学生创业信托基金奖(Ontario Student OpportunityTrust Fund Award)和UTF MBP卓越奖学金。除了这些披露,作者没有其他附属或财务上与任何机构或财政利益团体在本课题或本文所讨论的内容方面有任何关系。

 

编译者钱武东,李忠。译自《免疫治疗》2015, 7(3):271-284